李赛男 吕怡娜 姜焕焕 黄麟淇 区炳明 刘文华

摘要：【目的】构建表达甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV） VP39蛋白的vp39假型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica MNPV，AcMNPV），明确SeMNPV VP39是否能取代AcMNPV VP39在AcMNPV中行使功能，为深入探究杆状病毒的核衣壳装配机理打下理论基础。【方法】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统在AcMNPV vp39缺失型重组bacmid（bAcvp39KO）的基础上构建携带SeMNPV vp39基因、绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein，egfp）和多角体蛋白基因（Polyhedrin，polh）的重组病毒（vAcSevp39：FLAG）。利用Western blotting检测分析SeMNPV vp39在vAcSevp39：FLAG转染的草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9（Sf9）细胞中的表达情况，通过荧光显微镜观察vAcSevp39：FLAG在Sf9中的感染和扩散情况，采用病毒滴度测定并绘制病毒生长曲线检测vAcSevp39：FLAG的感染性芽生型病毒粒子产量，并以电子显微镜观察vAcSevp39：FLAG转染的Sf9细胞中的形态发生情况。【结果】Western blotting检测结果表明，SeMNPV VP39能在vAcSevp39：FLAG转染的Sf9细胞中获得表达;荧光显微镜观察和病毒生长曲线测定结果表明，在vAcSevp39：FLAG转染的Sf9细胞中无感染性的芽生型病毒粒子产生，与AcMNPV vp39缺失型重组病毒（vAcvp39KO）的现象一致;电子显微镜观察发现，与vAcvp39KO不同的是，在vAcSevp39：FLAG转染的细胞中虽然未产生核衣壳，但在感染细胞的核中存在大量空的透明长管状衣壳结构，表明SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣壳结构装配，但在AcMNPV中不具备装配核衣壳的能力。【結论】 SeMNPV VP39在AcMNPV中虽能形成衣壳结构，但不能有效装配核衣壳，导致无芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子产生。

关键词： 苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒; vp39; 甜菜夜蛾核多角体病毒; 芽生型病毒粒子; 核衣壳装配

0 引言

【研究意义】杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的病原微生物，其外形呈杆状，外具囊膜，基因组为双链闭合环状DNA（Rohrmann，2019）。在杆状病毒的一个感染周期中会产生2种功能形态各异的病毒粒子：芽生型病毒粒子（Budded virion，BV）和包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virion，ODV），二者的囊膜组分和来源各不相同，但遗传物质和核衣壳结构相近。迄今为止，杆状病毒核衣壳结构的装配机理尚不清楚。VP39蛋白是杆状病毒衣壳的主要结构蛋白，开展VP39蛋白功能研究对深入探究杆状病毒核衣壳的装配机制具有重要意义。【前人研究进展】杆状病毒科（Baculoviridae）可分为4个属，分别是Alphabaculovirus、Betabaculovirus、Gammabaculovirus和Deltabaculovirus（Jehle et al.，2006），其中，Alphabaculovirus又可进一步分为Group I和Group II核多角体病毒（Nucleopolyhedrovirus，NPV）（de A Zanotto et al.，1993）。Group I NPVs与Group II NPVs的核衣壳组成和结构相似，但BV的膜融合蛋白不同，Group I NPVs以GP64为膜融合蛋白，而Group II NPVs以F蛋白为膜融合蛋白。此外，Group I NPVs中存在含gp64在内的12个基因，在Group II NPVs中没有同源基因（Rohrmann，2019）。杆状病毒的核衣壳由基底结构、圆柱形的鞘和顶冠3部分组成（Fraser，1986）。新的病毒DNA在病毒发生基质（Virogenic stroma，VS）中合成后被压缩包装入衣壳形成核衣壳，衣壳装配过程可能不依赖于病毒DNA的压缩包装（Fraser，1986;Wang et al.，2016）。苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple NPV，AcMNPV）是杆状病毒的代表种，也是目前研究最广泛和最清楚的杆状病毒（Ayres et al.，1994）。AcMNPV基因组大小约134 kb，约编码150个开放阅读框（Open reading frame，ORF）（Ayres et al.，1994;Harrison and Bonning，2003;Maghodia et al.，2014;Rohrmann，2019）。AcMNPV vp39（orf89）的同源基因存在于所有已测序的杆状病毒基因组中，是杆状病毒的核心基因。vp39的特征最早在AcMNPV（Thiem and Miller，1989）和黄杉毒蛾核多角体病毒（Orgyia pseudotsugata MNPV）（Pearson et al.，1988）中被研究。在AcMNPV中，vp39位于AcMNPV基因组75534～76577 nt之间，全长1044 bp，编码347个氨基酸残基（Ayres et al.，1994）。已有研究表明，杆状病毒主要衣壳结构蛋白VP39以单体形式环状排列在核蛋白核心的周围（Pearson et al.，1988;Blissard et al.，1989;Thiem and Miller，1989;Wang et al.，2010b）。家蚕核多角体病毒（Bombyx mori NPV，BmNPV）vp39的缺失，导致BmNPV不能产生BV（Ono et al.，2012）。AcMNPV vp39的缺失导致核衣壳装配受阻（Bai et al.，2019），BmNPV VP39第276位保守甘氨酸位点的突变导致病毒核衣壳不能正确装配，病毒DNA不能正确包装进入衣壳（Katsuma and Kokusho，2017）。最近有研究表明，BmNPV VP39 C-末端的第192～286位氨基酸区域在核内肌动蛋白的聚合中具有关键作用（Zhang et al.，2020）。【本研究切入点】本课题组前期通过利用构建的C端融合FLAG标签的AcMNPV vp39全长补回型重组病毒（vAcvp39：FLAG）和AcMNPV vp39缺失型重组病毒（vAcvp39KO），发现VP39为病毒核衣壳装配的必需蛋白（Li et al.，2021），但其作用机理未明确。通过生物信息学分析发现，Group II NPVs的甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua MNPV，SeMNPV）VP39氨基酸序列与AcMNPV VP39氨基酸序列的相似性约43%，但SeMNPV VP39能否替代AcMNPV VP39在AcMNPV的生活周期中行使功能有待进一步探究。【拟解决的关键问题】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统在AcMNPV vp39缺失型重组bacmid（bAcvp39KO）的基础上构建携带SeMNPV vp39基因、绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein，egfp;本研究简写为gfp）和多角体蛋白基因（Polyhedrin，polh）的重组病毒（vAcSevp39：FLAG），以该重组病毒为基础，通过荧光显微镜观察、病毒滴度测定和电子显微镜观察分析SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39对AcMNPV的感染性BV产量和核衣壳装配的影响，为深入探究杆状病毒的核衣壳装配机理打下理论基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 质粒、病毒和昆虫细胞 含有SV40多聚腺苷酸化序列的质粒pUC18-SV40及携带gfp和polh双标记的质粒pFB1-PH-GFP为中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室构建（Wu et al.，2006;Cai et al.，2012）。缺失vp39基因的重组bacmid bAcvp39KO、携带polh和gfp双标记的vp39 C端融合FLAG标签的vp39全长补回型重组病毒vAcvp39：FLAG及携带polh和gfp双标记的vp39基因缺失型重组病毒vAcvp39KO由肇庆学院生命科学学院微生物资源开发与利用实验室构建（Li et al.，2021）。来源于草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9（Sf9）细胞株由中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室馈赠。Sf9细胞培养于添加有胎牛血清（10%）、青霉素（100 μg/mL）和链霉素（30 μg/mL）的TNM-FH培养基中，培养温度为27 ℃。

1. 1. 2 主要试剂 克隆载体pMD18-T为TaKaRa公司产品;限制性内切酶和预染标准蛋白Marker购自Thermo Scientific公司;氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环霉素、IPTG和X-gal均购自Sigma公司;DNA电泳Marker购自广州东盛生物科技有限公司;Anti-FLAG鼠单克隆抗体购自Abmart公司;bacmid DNA碱法提取试剂（Solution I、Solution II和Solution III）、质粒小量提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）構建参照Daimon等（2005）的方法进行重叠PCR。以AcMNPV基因组DNA为模板，采用引物对Acvp39PF1（5'-GAGCTCCAAATTTGATTTCAATTTTATCGTG TTGGT-3'）/Acvp39PR1（5'-GAGGAGACAGGCGTC AGAGCCATATTGTTGCCGTTATAAATATGGA-3'）扩增得到AcMNPV vp39基因的启动子区域（76578～76977 nt）;以SeMNPV基因组DNA为模板，采用引物对Acvp39PF2（5'-TCCATATTTATAACGGCAACAAT ATGGCTCTGACGCCTGTCTCCTC-3'）/Acvp39PR2（5'-GGTACCCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAA TCGACGACGGCCGTGGGCCGAAGC-3'）扩增得到在C端融合有FLAG标签的SeMNPV vp39 ORF片段（73243～74223 nt）。PCR反应体系50.0 μL：2×PrimeSTAR Max DNA聚合酶25.0 μL，20 ng DNA模板，正、反向引物各10 pmol，灭菌双蒸水补足至50.0 μL。扩增程序：98 ℃预变性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。分别回收PCR片段，以2个PCR扩增片段的混合物为模板进行重叠PCR。PCR反应体系48.0 μL：2×PrimeSTAR Max DNA聚合酶25.0 μL，回收的2个PCR扩增片段各600 ng，灭菌双蒸水补足至48.0 μL。扩增程序：98 ℃预变性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，进行4个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。在上述PCR管中加入引物Acvp39PF1和Acvp39PR2各10 pmol，重新进行PCR扩增，扩增程序：98 ℃预变性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。回收重叠PCR扩增产物，克隆至pMD18-T载体，经Sac I/Kpn I双酶切鉴定正确后，委托北京睿博兴科生物技术有限公司广州分公司对插入的DNA片段进行测序鉴定。从测序正确的质粒上以Sac I/Kpn I双酶切下插入的Sevp39：FLAG片段，连接至经Sac I/Kpn I双酶切且含有SV40多聚腺苷酸化序列的pUC18-SV40质粒上（Cai et al.，2012），即得到重组质粒pUC18-Sevp39：FLAG，使用Sac I/Xba I双酶切下携带SV40多聚腺苷酸化序列的Sevp39：FLAG线性片段，克隆至携带polh启动子启动表达的polh基因及AcMNPV ie1启动子启动表达的gfp基因的pFB1-PH-GFP载体（Wu et al.，2006），得到转座载体pFB1-Sevp39：FLAG。

将转座载体pFB1-Sevp39：FLAG转化到CaCl2法制备的含重组bacmid bAcvp39KO的DH10Bac感受态细胞中。通过转座子Tn7介导的转座（Luckow et al.，1993），将AcMNPV vp39基因启动子控制下的SeMNPV vp39基因及SV40多聚腺苷酸化信号序列、polh和gfp基因一起插入bAcvp39KO的polh位点，构建携带polh和gfp双标记的vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）。分别使用引物对Acvp39PF1/Acvp39PR2、Acvp39PF1/M13R（5'-CAGGAAACAG CTATGAC-3'）、M13F（5'-GTTTTCCCAGTCACGA C-3'）/Acvp39PR2和M13F/M13R对构建的重组病毒进行PCR鉴定及测序验证。

1. 2. 2 转染昆虫细胞 参照Bac-to-Bac表达系统操作手册和Wu等（2006）的方法，定量1 μg vAcvp-39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA分别转染Sf9细胞单层（1.0×106），以添加新鲜含胎牛血清细胞培养基的时间点记为0 h。利用荧光倒置显微镜（Nikon ECLIPSE TE2000-U）在转染后（Post-transfection，p.t.）24、48、72和96 h观察病毒的复制和扩散情况。参照OReilly等（1992）的方法，收集0、24、48、72、96和120 h p.t.的细胞培养上清液，用半数组织培养物感染剂量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）测定病毒滴度。

1. 2. 3 Western blotting检测分析 分别定量1 μg vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG bacmid DNA转染Sf9细胞单层（1.0×106），在96 h p.t.收集细胞，使用12% SDS-PAGE进行电泳，以anti-FLAG鼠单克隆抗体进行Western blotting检测分析，以检测病毒感染Sf9细胞中SeMNPV VP39的表达。

1. 2. 4 透射电镜观察 分别定量2 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA转染Sf9细胞单層（1.0×106），于72 h p.t.以细胞刮轻轻刮下细胞，4 ℃下2000 r/min离心10 min，收集Sf9细胞，透射电镜样品的制备参照Yuan等（2008）的方法。以120 kV的加速电压在透射电子显微镜（JEOL JEM-1400）下对样品进行观察，拍照记录试验结果。

2 结果与分析

2. 1 vAcSevp39：FLAG的构建和验证结果

以AcMNPV基因组DNA为模板，采用引物对Acvp39PF1/Acvp39PR1扩增出AcMNPV vp39基因启动子区域;同时以SeMNPV基因组DNA为模板，采用引物对Acvp39PF2/Acvp39PR2扩增出在C端融合有FLAG标签的SeMNPV vp39 ORF片段。分别回收PCR片段，以PCR片段的混合物为模板，以引物对Acvp39PF1/Acvp39PR2进行重叠PCR，扩增片段1405 bp（图1，泳道1）。回收该重叠PCR的产物，克隆至pMD18-T载体上，经Sac I/Kpn I双酶切鉴定，获得2692 bp的pMD18-T载体片段和约1405 bp的目的片段（图1，泳道2），与预期结果一致。将测序正确的克隆子命名为T-Sevp39：FLAG。用Sac I/Kpn I从T-Sevp39：FLAG切下目的片段，连接至经同样酶切的pUC18-SV40质粒上（Cai et al.，2012），得到重组质粒pUC18-Sevp39：FLAG，用Sac I/Kpn I进行酶切鉴定，获得约2927 bp的pUC18-SV40载体片段和约1405 bp的目的片段，与预期结果一致（图1，泳道3）。采用Sac I/Xba I从pUC18-Sevp39：FLAG切下目的片段，插入经同样酶切的pFB1-PH-GFP载体（Wu et al.，2006），得到转座载体pFB1-Sevp39：FLAG，使用Sac I/Xba I进行双酶切鉴定，获得的片段与预期结果相符（载体pFB1-PH-GFP片段约7300 bp，带有SV40多聚腺苷酸化序列的Sevp39线性片段约1652 bp），表明转座载体pFB1-Sevp39：FLAG构建成功（图1，泳道4）。

重组病毒vAcSevp39：FLAG的构建如图2所示。以转座载体pFB1-Sevp39：FLAG转化bAcvp39KO感受态细胞，通过位点特异性重组，polh、gfp及在AcMNPV vp39启动子控制下且在C端融合表达FLAG标签（图2中以灰色三角符号标识）的SeMNPV vp39基因一起插入重组bacmid bAcvp39KO的polh基因位点，即获得携带SeMNPV vp39基因的vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）。

对获得的重组病毒vAcSevp39：FLAG进行PCR验证，引物对Acvp39PF1/Acvp39PR2、M13F/Acvp39-PR2、Acvp39PF1/M13R和M13F/M13R在重组病毒中可分别扩增出大小约1405、4150、3450和6000 bp的条带，产物大小与预期结果相符（图3），而在bAcvp39KO中未扩增出任何条带（文中未显示）。回收PCR产物，进行测序鉴定，结果表明重组病毒构建成功。

2. 2 SeMNPV vp39在AcMNPV中的表达检测结果

分别定量1 μg vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG bacmid DNA转染Sf9细胞，在96 h p.t.收集细胞，进行SDS-PAGE电泳，并以anti-FLAG鼠单克隆抗体进行Western blotting检测分析，结果（图4）显示，在vAcSevp39：FLAG bacmid DNA转染的Sf9细胞样品中能特异性检测到SeMNPV VP39的条带，而在vAcvp39KO转染的Sf9细胞样品中未检测出任何条带，表明SeMNPV VP39能在vAcSevp39：FLAG转染的Sf9细胞中表达。

2. 3 重组病毒转染Sf9细胞的显微镜观察和病毒生长曲线测定结果

定量1 μg vAcSevp39：FLAG的bacmid DNA转染Sf9细胞，以AcMNPV vp39缺失型重组病毒vAcvp-39KO为阴性对照，以AcMNPV vp39补回型重组病毒vAcvp39：FLAG为阳性对照，利用荧光显微镜观察病毒的感染和扩散情况，结果如图5所示。24 h p.t.，在vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3种重组病毒转染的Sf9细胞中约有20%的细胞产生荧光，荧光分布情况也基本一致，表明三者具有基本一致的转染效率。72 h p.t.，在vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG转染的Sf9细胞中产生荧光的细胞数与24 h p.t.相比未见增加，而vAcvp39：FLAG转染Sf9细胞中几乎所有的细胞均可观察到绿色荧光，说明vAcSevp39：FLAG不能产生可感染性的BV。96 h p.t.，普通光镜观察结果显示，在vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3种重组病毒转染的Sf9细胞中均能产生包涵体（Occlusion body，OB）（图5），表明3种重组病毒感染Sf9细胞的进程基本一致。

为进一步确定vAcSevp39：FLAG的感染性BV产生能力，分别定量1 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3种重组病毒bacmid DNA转染Sf9细胞，收取转染后不同时间点的细胞培养上清液，测定病毒滴度，绘制病毒生长曲线，结果如图6所示。在vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG转染的细胞中，从24 h p.t.到120 h p.t.均未检测到感染性病毒粒子BV产生，而在vAcvp39：FLAG转染的细胞中，从24 h p.t.开始检测到病毒滴度，至96 h p.t.达高峰，表明其产生BV的能力较高。

综合显微镜观察和转染生长曲线的结果，SeMNPV VP39不能替代AcMNPV VP39在AcMNPV BV产生中行使功能。

2. 4 重组病毒转染Sf9细胞的透射电镜观察结果

为确定SeMNPV VP39替代AcMNPV VP39对病毒形态发生的影响，分别定量2 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA转染Sf9细胞，于72 h p.t.收集Sf9细胞，制备电镜样品，使用透射电子显微镜对样品进行电镜观察，结果如图7所示。在vAcvp39：FLAG转染的Sf9细胞中显示出杆状病毒感染的典型特征，包括含有大量正常形态核衣壳的VS在核内形成（图7-a），在细胞核中VS外的环带区域可观察到大量病毒诱导产生的微囊泡（文中未显示）、大量含有核衣壳的ODV（图7-b）和包埋有大量ODV的OB（图7-c）。在vAcvp39KO转染的Sf9细胞中，虽然能形成与vAcvp39：FLAG形态相似的VS，但在VS和环带区域未观察到任何衣壳结构，大量不正常的电子致密小体（图7-d中以白色箭头标识）出现在VS中（图7-d），在环带区域可观察到大量的微囊泡，但无ODV出现在环带区域（图7-e）和OB中（图7-f）。在vAcSevp39：FLAG转染的Sf9细胞中，与vAcvp39KO现象类似，可观察到无任何衣壳结构但具有大量的电子致密小体（图7-g中以白色箭头标识）的VS（图7-g），而这些电子致密小体常存在于不能产生正常核衣壳的AcMNPV感染的细胞中（Olszewski and Miller，1997;Zhu et al.，2013;Guan et al.，2016）;环带区域有大量的微囊泡，但无ODV（图7-h），OB中无ODV包埋（图7-i）;但与vAcvp39KO不同的是，在vAcSevp39：FLAG转染的Sf9细胞核中可观察到大量异常的缺乏电子致密核心即含有病毒DNA的核蛋白的电子透明的长衣壳结构（图7-h中以白色三角形标识）。

综合上述观察结果，SeMNPV VP39在AcMNPV的衣壳结构装配中具有功能，但不能挽救vAcvp39KO的核衣壳形成。

3 讨论

VP39是杆状病毒核衣壳最主要的结构蛋白，在所有已测序的杆状病毒基因组中保守（Pearson et al.，1988;Blissard et al.，1989;van Oers and Vlak，2007;Wang et al.，2010b）。本課题组前期通过构建C端融合FLAG标签的AcMNPV vp39全长补回型重组病毒vAcvp39：FLAG和vp39缺失型重组病毒vAcvp39KO，并证实AcMNPV vp39的缺失导致病毒核衣壳装配受阻（Li et al.，2021）。本研究在bAcvp39KO的基础上构建表达C端融合FLAG标签的SeMNPV VP39的vp39假型AcMNPV，并利用该重组病毒探究SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39对AcMNPV的病毒产生和核衣壳装配的影响，结果表明，SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39导致病毒不能产生可感染性的病毒粒子BV，也未能装配产生核衣壳，但能产生大量电子透明的不含病毒DNA的长管状衣壳类似结构，即SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣壳装配，但在AcMNPV中不具备装配核衣壳的能力。

与vAcSevp39：FLAG表型相似，一些杆状病毒核衣壳相关基因的缺失会导致AcMNPV的核衣壳装配受阻及产生大量不正常的空的长管状衣壳类似结构，这些基因包括vlf-1（Vanarsdall et al.， 2006）、38k（Wu et al.，2006）、ac53（Liu et al.，2008）、BV/ODV-C42（Li et al.，2010）、p6.9（Wang et al.， 2010a）、pk-1（Liang et al.，2013）、vp91（Zhu et al.， 2013）、vp1054（Guan et al.，2016）和ac102（Hepp et al.，2018）。核衣壳基底结构蛋白P78/83是Wiskott-Aldrich蛋白家族成员（Russell et al.，1997;Goley et al.，2006），在杆状病毒感染细胞内丝状肌动蛋白（Filamentous actin，F-actin）的形成过程中具有重要作用，F-actin为核衣壳的正确组装提供支架（Goley et al.，2006;Ohkawa et al.，2010;Rohrmann，2019）。BV/ODV-C42基因编码的BV/ODV-C42蛋白是新合成的P78/83从细胞质进入细胞核行使功能的必需蛋白，同时，BV/ODV-C42蛋白还通过抑制P78/83的降解而使其保持性能稳定（Wang et al.，2008;Wang et al.，2015）。近年来，有研究表明，BV/ODV-C42蛋白能与P78/83、ODV-EC27和ac102编码的Ac102蛋白相互作用形成P78/83-BV/ODV-C42-ODV-EC27-Ac102蛋白复合物（Hepp et al.，2018）。Ac102通过与BV/ODV-C42蛋白相互作用而抑制BV/ODV-C42的泛素化，降低BV/ODV-C42的蛋白酶降解，从而保证P78/83启动actin聚合形成F-actin的活性（Zhang et al.，2018）。此外，p6.9基因编码的P6.9蛋白能与杆状病毒DNA结合，并负责杆状病毒新合成DNA的压缩以利于包装进衣壳形成核衣壳（Funk and Consigli，1993;Liu et al.，2012），38k基因编码的蛋白38K在P6.9去磷酸化从而行使此功能中发挥关键作用（Lai et al.，2018）。

核衣壳装配是一个需要大量蛋白共同参与的复杂过程。有研究表明，VP39与其自身及核衣壳相关蛋白38K、ODV-EC27、BV/ODV-C42、P78/83和宿主细胞蛋白actin间存在相互作用（Lanier and Volkman，1998;Lu et al.，2004;Braunagel and Summers，2007;Wu et al.，2008），暗示VP39与这些蛋白通过相互作用共同参与核衣壳的装配，且这些相互作用在核衣壳的装配中发挥关键作用。蛋白发生相互作用后，其空间构象与单个蛋白相比可能会发生转变（Makalliwa et al.，2018）。本研究发现，以SeMNPV VP39替代AcMNPV VP39导致病毒核衣壳装配受阻，尽管在感染细胞的核中出现许多缺乏病毒DNA的空的长管状衣壳类似结构，考虑到SeMNPV VP39与AcMNPV VP39的氨基酸序列相似性只有43%，相对偏低。因此，在vAcSpltvp39：FLAG感染Sf9细胞中SeMNPV VP39可能不被AcMNPV的38K、ODV-EC27、BV/ODV-C42、P78/83或其他相关蛋白充分识别而产生相互作用或相互作用较弱，从而可能影响这些蛋白的构象转变。蛋白构象的不完全转变可能导致蛋白不能充分行使功能，如SeMNPV VP39与AcMNPV 38K较弱的相互作用可能引起38K构象发生不完全转变，从而导致38K的活性降低，活性较低的38K可能不足以适当介导P6.9的去磷酸化，致使在vAcSpltvp39：FLAG中无病毒DNA包装进入衣壳形成正常的核衣壳。这些结果也暗示vp39虽然是杆状病毒核心基因，存在于所有杆状病毒中，但vp39基因已进化以适应每种病毒与宿主的相互作用，从而有利于病毒在宿主中的复制和扩增。

4 结论

本研究成功构建能表达C端融合FLAG標签的SeMNPV VP39的vp39假型AcMNPV，且发现SeMNPV VP39虽然在AcMNPV的衣壳装配中具有功能，但在AcMNPV中不具有装配形成核衣壳的能力，导致vp39假型AcMNPV不能产生BV和ODV。本研究结果不仅为进一步探究杆状病毒核衣壳的装配机制打下基础，还为探究保守基因进化以适应每种病毒与宿主的相互作用提供了信息。

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（責任编辑 麻小燕）