冯学轩 王 弋 严家荣 饶子亮 梁秋玲 邝少松（广东省医学实验动物中心，广州528248）

免疫是机体至关重要的保护性生理功能，可有效地识别危险信号，抵御外来病原微生物的入侵并清除体内有害物质，最终维持自身内环境的稳定状态。但免疫力一旦下降，机体的抵抗能力也将随之降低，容易引起疾病的发生[1-2］。可见，提高免疫力对维持人体健康有着重要意义。目前，临床上虽然有着不少的免疫增强剂可用于提高人体免疫力，但成本高，副作用大，并不适合正常人群使用，为此，本研究拟将天然活性蛋白乳清蛋白、小麦蛋白与酵母β-葡聚糖进行组合，以求开发出安全性高、可供正常人群使用的增强免疫力保健食品。

众多研究指出，蛋白质是维持和修复机体以及细胞生长所必需的重要营养物质，在体内水解为氨基酸被吸收后重新合成各种蛋白质，这其中就包括了免疫细胞生成和抗体合成所需的蛋白质，但蛋白质在体内不能被贮存，必须水解成氨基酸后才能被利用[3-4］。因此，所摄入蛋白质的氨基酸构成成为了其发挥作用的关键。乳清蛋白其主要成分为β-乳球蛋白（48%），α-乳白蛋白（19%），它们是必需氨基酸和支链氨基酸的良好来源，其中的必需氨基酸含量还远高于植物性来源的蛋白质，这些必需氨基酸参与了绝大多数免疫因子的合成，而支链氨基酸对于组织的生长和修复起着十分重要的作用[5-6］。小麦蛋白则富含谷氨酸和脯氨酸，能提供人体淋巴细胞所需的营养成分、促进免疫球蛋白分泌并调节肠内营养，与乳清蛋白组合可为机体免疫反应提供氨基酸原料，是免疫反应的物质基础，但光有物质基础并不能充分调动机体的免疫效能[7］。因此，本研究创新性地加入了酵母β-葡聚糖。酵母β-葡聚糖具有特殊的三维结构，能与巨噬细胞和中性粒细胞、淋巴细胞表面受体结合，影响细胞的信息传递过程，激活淋巴细胞的免疫活性，使其能够快速地到达病原所在位置，是免疫反应的助推剂，协助乳清蛋白和小麦蛋白发挥免疫增强作用[8-10］。但该组合应用尚属首次，其功效也未被验证，为此本研究拟通过一系列免疫试验验证该组合的功效，也为其后续的开发利用提供基础的药效学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和饲养环境 5 个实验分别采用50 只SPF 级BALB/c 小鼠，雄性，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证：SCXK（粤）2018-0002。动物饲养在SPF 级动物房。实验动物合格证号：44007200069671、44007200070000、44007200069588、44007200069996、44007200069970，饲养温度与湿度：20～26℃，40%～70%，采用12 h 昼夜间断照明。动物自由进食和饮水，所有饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供。 试验伦理编号：A201910-4、 A201910-2、 A201910-6、 A201910-5、A201910-3。本试验涉及的与动物试验相关的内容和程序遵从实验动物使用和管理的相关法律法规及广东省医学使用动物中心实验动物伦理委员会的相关规定。

1.1.2 药物及主要试剂 乳清蛋白、小麦蛋白与酵母β-葡聚糖组合物：每4.2 g 组合物含酵母β-葡聚糖0.14 g，（汤臣倍健股份有限公司）；转移因子口服溶液（批号190315，南京瑞尔医药有限公司）；2，4-二硝基氟苯（DNFB，批号C10266157，麦克林公司）；丙酮（批号20170202-2，广州化学试剂厂）；橄榄油（批号C10438064，麦克林公司）；薇婷脱毛膏[批号2022011610H，利洁时家化（中国）有限公司］；氯化钠注射液（批号G19052106-1，广东科伦药业有限公司）；印度墨汁（批号1126A18，雷根生物有限公司）；无水碳酸钠（批号20180709，广东光华科技股份有限公司）；脱纤维绵羊血（批号Y18N10D103400，源叶生物有限公司）；Triton X-100（批号84000150，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；PBS（批号94F001200，广州鼎国科技有限公司）；Tris base（批号7626010160，Genview公司）；盐酸（批号20170204-1，广州化学试剂厂）；乳酸锂（批号C10096217，麦克林公司）；硝基氯化四氮唑（INT，批号C10079977，麦克林公司）；吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS，批号71222010120，Genview 公司）；氧化型辅酶Ⅰ（NAD，批号8830010130，GENVIEW 公司）；刀豆蛋白A（Con A，批号SLBP2641V，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；MTT（批号7101K，MP 公司）；异丙醇（批号20190303，广东光华科技股份有限公司）。

1.1.3 主要仪器 JEA3001型电子天平（感量0.1 g，上海浦春计量仪器有限公司）；BSA224S型电子天平（感量0.1 mg，德国Sartorius 公司）；Multiskan GO 型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；GHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KDC-2046低速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州净化有限公司）；荧光倒置相差显微镜（型号CKX41，日本奥林巴斯公司）；CCL-170B-8CO2 培养箱（新加坡ESCO公司）。

1.2 方法 将小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照组、组合物低、中、高剂量组，10只/组，共5组。分组后，阳性对照组灌胃转移因子口服液原液，组合物低、中、高剂量组分别按0.7、1.4、2.1 g/kg的剂量灌胃受试物溶液，阴性对照组动物灌胃溶媒（0.5%CMC-Na溶液），灌胃体积20 ml/kg，1次/d，连续30 d，末次给药后进行下列各项试验。

1.2.1 小鼠淋巴细胞增殖的影响试验 给药30 d后各组动物安乐死后无菌取脾，将脾置于200 目筛网上并浸于无菌Hank's 液中，轻轻研磨并制成单细胞悬液，1000 r/min，离心10 min，沉淀细胞经红细胞裂解液裂解红细胞后，RPMI1640 完全培养液重悬淋巴细胞，用台盼兰染色计算活细胞数（应在95% 以上），用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为3×106个/ml。将每份脾细胞悬液分2孔加入24孔培养板中，每孔1 ml，一孔加75 µl ConA 液，另一孔加入75 µl培养液作对照。置细胞培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔吸去0.7 ml 上清液，加入0.7 ml 不含胎牛血清的RPMI1640 培养液，同时按50 µl/孔加入5 mg/ml MTT 溶液，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 ml 酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解后分装至96 孔板中，每孔做3 个平行孔，酶标仪570 nm 测定吸光度。按下式计算脾淋巴细胞增殖能力。脾淋巴细胞增殖能力=Con A孔吸光度值−无Con A孔吸光度值。

1.2.2 小鼠迟发型变态反应试验 给药25 d，动物腹部用薇婷脱毛膏脱毛，面积约为3 cm×3 cm，脱毛后用50 µl 的DNFB 溶液均匀涂抹脱毛区域致敏。5 d 后，用10 µl 的DNFB 溶液均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击，攻击后24 h 颈椎脱臼处死小鼠，用打孔器取下直径约为8 mm的耳片，分别称重。计算左右耳片重量之差。

1.2.3 小鼠血清溶血素生成试验 给药27 d，每只小鼠腹腔注射2% 绵羊血压积红细胞悬液0.2 ml。给药30 d 后动物眼眶静脉窦采血，2000 r/min 离心10 min，取血清。用生理盐水将血清倍半稀释11 次共得11个稀释度的血清，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100 µl，再加入100 µl 0.5%（v/v）的绵羊血压积红细胞悬液，混匀，于湿润的平盘内加盖37℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度：分5 级（0～Ⅳ）记录，并按下式计算抗体积数：抗体积数=（S1+2S2+3S3+……nSn），式中1、2、3、……n代表对倍稀释的指数，S 代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。0 级，红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清澈；Ⅰ级，红细胞大部分沉集在孔底成圆点状，四周有少量凝集的红细胞；Ⅱ级，凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点；Ⅲ级，凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点；Ⅳ级，凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

1.2.4 小鼠碳廓清试验 给药30 d 后，各组动物按10 ml/kg 的注射体积尾静脉注射稀释为原液3 倍的印度墨汁。注入墨汁后2、10 min，分别从眼眶静脉窦采血20 µl，并立即加到2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白对照，用酶标仪在600 nm波长处测定光密度值（OD），同时剖取肝脏和脾脏称重，按下式计算吞噬指数a：a=体重/（肝重+脾重）（lgOD1−lgOD2）/（t2−t1）。

1.2.5 靶细胞（YAC-1）传代 YAC-1细胞传代培养3 代后，试验时将靶细胞混悬液1000 r/min 离心10 min，沉淀细胞加入RPMI1640完全培养液吹散，台盼兰染色计算活细胞数后调整细胞浓度为4×105个/ml。

1.2.6 小鼠NK 细胞活性试验 给药30 d 后各组动物安乐死后无菌取脾，将脾置于200 目筛网上并浸于无菌Hank's 液中，轻轻研磨并制成单细胞悬液，1000 r/min离心10 min，沉淀细胞经红细胞裂解液裂解红细胞后，RPMI1640完全培养液重悬淋巴细胞，用台盼兰染色计算活细胞数（应在95%以上），用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/ml。取靶细胞YAC-1和效应细胞（脾淋巴细胞）各100 µl（效靶比50∶1），加入U 型96 孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 µl；靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton 各100 µl，上述各项均设3 个平行孔，细胞培养箱中培养4 h 后将U 型96 孔培养板离心并吸取上清100 µl 置于96 孔培养板中，同时加入LDH 基质液100 µl，反应6 min 后每孔加入1 mol/L 的HCl 30 µl，在酶标仪490 nm 处测定光密度值（OD）。按下式计算NK细胞活性：NK细胞活性（%）=（反应孔OD−自然释放孔OD）/（最大释放孔OD−自然释放孔OD）×100%。

1.3 统计学方法 所有数据采用±s表示，应用SPSS21.0 软件进行统计分析，小鼠迟发型变态反应试验左右耳片重量差值采用秩和检验。其余各项试验采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠脾淋巴细胞增殖试验 结果见图1。与阴性对照组相比，阳性对照组、组合物中、高剂量组脾淋巴细胞增殖能力明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），组合物低剂量组无统计学意义（P>0.05）。

图1 Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力Fig.1 Proliferation of mice Con A-induced splenocytes

2.2 小鼠迟发型变态反应试验左右耳片重量差值 与阴性对照组相比，各组左右耳片重量差值均无统计学意义（P>0.05，表1）。

表1 小鼠迟发型变态反应试验左右耳片重量差值（±s，n=10，mg）Tab.1 Weight difference between left and right ear of mice in delayed-type hypersensitivity response（±s，n=10，mg）

表1 小鼠迟发型变态反应试验左右耳片重量差值（±s，n=10，mg）Tab.1 Weight difference between left and right ear of mice in delayed-type hypersensitivity response（±s，n=10，mg）

Groups Negative control Positive control Combination low dose Combination middle dose Combination high dose Dose−20 ml/ kg 0.7 g/ kg 1.4 g/ kg 2.1 g/ kg Weight difference between left and right ear 19.2±5.120.1±2.120.6±4.019.9±2.220.4±5.5

2.3 小鼠血清溶血素生成试验 与阴性对照组相比，阳性对照组、组合物中剂量组血清溶血素抗体积数明显升高，均有统计学意义（P<0.05，图2），其余各组无统计学意义（P>0.05，图2）。

图2 小鼠血清溶血素生成试验抗体积数结果Fig.2 Results of antibody titre level in mice serum hemo⁃lysin production test

2.4 小鼠碳廓清试验 与阴性对照组相比，阳性对照组、组合物低、中剂量组吞噬指数明显升高，均有统计学意义（P<0.05，图3），组合物高剂量组无统计学意义（P>0.05，图3）。

图3 小鼠碳廓清试验吞噬指数结果Fig.3 Results of phagocytic index in mice carbon clear⁃ance test

2.5 小鼠NK细胞活性试验 与阴性对照组相比，阳性对照组、组合物高剂量组NK细胞活性明显升高（P<0.05，图4），其余各组无统计学意义（P>0.05，图4）。

图4 小鼠NK细胞活性试验结果Fig.4 Results of mice NK cell activity test

3 讨论

免疫系统作为人体的一道天然屏障，具有免疫监视、防御、调控的作用，可分为特异性免疫和非特异性免疫，前者又分为细胞免疫和体液免疫，分别由T 淋巴细胞和B 淋巴细胞发挥作用，后者则主要由固有免疫细胞，如单核巨噬细胞，NK 细胞等发挥作用。因此，现代医学在评价免疫功能时也主要从细胞免疫、体液免疫、单核巨噬细胞吞噬能力及NK细胞活性这四个方面进行[11］。为此，本研究通过脾淋巴细胞增殖试验、迟发型变态反应试验、血清溶血素生成试验、碳廓清试验及NK 细胞活性试验，评价乳清蛋白、小麦蛋白与酵母β-葡聚糖组合后对机体特异性免疫和非特异性免疫功能的影响。

试验结果显示，乳清蛋白和小麦蛋白配伍酵母β-葡聚糖，有2 个剂量在提高脾淋巴细胞增殖能力（1.4 及2.1 g/kg），增强巨噬细胞吞噬能力（0.7 及1.4 g/kg）上发挥作用，有1 个剂量在提高血清溶血素生成水平（1.4 g/kg）及提高NK细胞活性（2.1 g/kg）上发挥作用。由此可见，将天然蛋白提取物乳清蛋白和小麦蛋白与酵母β-葡聚糖组合，确实具有增强免疫力的功效。且其作用效果初步估计是以提高细胞免疫中的脾淋巴细胞增殖能力及增强非特异性免疫中的巨噬细胞吞噬能力为主，以提高体液免疫中的血清溶血素生成水平及增强非特异性免疫中的NK细胞杀伤活性为辅。

在特异性免疫方面，细胞免疫主要由T 淋巴细胞介导，T 淋巴细胞的增殖能力决定了效应T 细胞的数量及细胞免疫应答的强度，直接反映了机体的细胞免疫功能[12-14］。乳清蛋白和小麦蛋白在体内可分别被水解为必需氨基酸和谷氨酸，必需氨基酸是蛋白合成的重要原料，而谷氨酸则参与三羧酸循环，为蛋白质合成提供能源[7，15］，这些都为T 细胞的增殖提供物质基础，因此可发现在淋巴细胞增殖能力试验中，该组合对Con A 特异性诱导T 淋巴细胞增殖具有良好的促进作用。T 淋巴细胞的增多，还能协助参与体液免疫的B细胞分化成浆细胞产生抗体和分泌相关细胞因子[16-17］，乳清蛋白中的亮氨酸和精氨酸也直接参与免疫因子的合成，酵母β-葡聚糖协助调节细胞因子表达[5，10］。因此，动物在给予该组合物30 d 后，可见介导体液免疫的抗体成分血清溶血素的抗体积数升高，侧面反映了B细胞的增殖分化以及与补体结合后释放抗体的能力有所上升[18］。

在非特异性免疫方面，单核巨噬细胞是非特异性免疫的重要执行者，它有利于病原微生物的吞噬，自身衰老损伤细胞的清除，且有利于对抗原的摄取、加工、处理、提呈并激发免疫反应[12，19-20］。酵母β-葡聚糖作为新资源食品，其独特的三重超螺旋结构，最容易被人体吸收，它能促进细胞有丝分裂，增加单核细胞和中性粒细胞数量[21］，也能与淋巴细胞表面受体结合，协助免疫细胞发挥作用，被多次报道具有增强巨噬细胞吞噬能力的功效，在增强非特异性免疫方面表现出色，当配伍活性蛋白成分乳清蛋白和小麦蛋白后，其提高单核巨噬细胞吞噬能力的作用得到进一步提高，实验中2 个剂量均具有提高单核巨噬细胞吞噬能力的作用，也是该组合发挥特异性免疫的主要作用层面[8-9，22］。在此以外，该组合还能提高NK 细胞活性。NK 细胞是天然防御的功能细胞，可对机体进行免疫清除和免疫监视，其杀伤范围远大于T 细胞，在无致敏源刺激的情况下也能发挥免疫功能，杀伤多数受感染细胞，维护机体免受感染[17，23-24］。

通过以上的理论和实验证明，乳清蛋白和小麦蛋白可为免疫反应提供物质基础，酵母β-葡聚糖协助发挥推动效应，三者结合可有效地提高机体的免疫效能。本次研究也为蛋白类成分及多糖类成分的组合应用和开发提供了研究方向和基础资料。