邢子伟，林艳艳，伦雪恩，谭翰清＊

（1.肇庆市医学高等专科学校，广东 肇庆 526020；2.肇庆市疾病预防控制中心，广东 肇庆 526060）

0 引言

核酸检测是新型冠状肺炎病原学诊断的金标准[1]，其检测结果的准确性、时效性严重地影响着我们防控措施及效果，特别是对应检尽检的发热病例需要在6 h出具报告，愿检尽检人群应在12~24 h内报告，核酸检测报告需要快而准。核酸提取试剂盒的质量是影响荧光PCR检测结果的关键环节[2]。当前我国部分省区以联盟的形式开展核酸提取和检测试剂的带量集采[3]，不同品牌的提取试剂盒的市场价格均实现了大幅度的降低，使用单位需要加强核酸提取试剂的质控。本研究评估三种磁珠法核酸提取试剂的提取效能和时效性，为保障新冠核酸检测结果的准确供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂。实时荧光PCR仪（美国赛默飞7500fast）、自动核酸提取仪（西安天隆NP968）、冷冻离心机（德国eppendorff）等；预分装型核酸提取试剂盒（重庆中元，磁珠法），2019-ncov新型冠状病毒核酸检测试剂盒（中山大学达安基因有限公司）；阳性质控品（广东省疾病预防控制中心提供）。

1.2 方法

1.2.1 测试样本的制备与核酸提取：将灭活型的新冠病毒阳性质控品（原始Ct值约28）进行梯度稀释，制备成五个含有不同病毒浓度的样本，各取200 μL分别加至三种不同品牌的磁珠法核酸提取试剂盒，96孔预分装板的1和7列裂解孔，第6和12列核酸洗脱体积100 μL，分别在提取仪上按相应使用说明书设置程序，历经裂解、吸附、洗涤和洗脱环节，完成自动提取。其中品牌A为重庆中元，其核酸提取试剂盒在提取仪的的程序设置仅需一步洗涤，总时长约10 min，见表1；另外两个品牌B和C试剂盒在裂解吸附步骤后分别需洗涤2次和3次，总时长分别约20 min、30 min。

表1 品牌A核酸提取试剂盒运行程序的设置

1.2.2 实时荧光RT-PCR检测：采用中山大学达安基因的2019-nCoV新型冠状病毒荧光PCR试剂盒，反应体积25μL，核酸模板5μL，反应程序为：50℃逆转录15 min；95℃灭活15min；94℃变性15 s，55℃、45 s（末端收集荧光），45循环。Orf1ab/N/RNP内参基因分别选择“FAM”、“VIC”、“CY5”通道，淬灭基团和校正均选“NONE”。结果判定以在阴性对照、阳性对照成立的条件下，各靶标有“S”型扩增曲线则判为阳性。

1.2.3 结果比较分析：分别对经三种核酸提取试剂盒提取核酸的荧光PCR检测效果比较，根据Ct值、扩增效果图、检测灵敏度、提取步骤与时长等因素综合比较。

2 结果

2.1 实时荧光RT-PCR检测结果。5个稀释梯度的模拟样本分别经A、B、C品牌磁珠法提取试剂盒提取，各自产物对同一种新冠荧光PCR试剂检测灵敏度有差异。A品牌对5个稀释梯度均有orf1ab/N双靶基因扩增阳性；B品牌对前4个稀释梯度有orf1ab/N双靶基因扩增阳性，第5个稀释梯度扩增阴性；C品牌对前3个稀释梯度均有orf1ab/N双靶基因扩增，第4个稀释梯度仅有N靶基因均扩增阳性，第5个稀释梯度扩增阴性。从扩增图效果来看，A、B、C品牌依次递减，品牌A双靶基因均呈典型“S”扩增曲线，荧光强度均比另外两个品牌的高（图1）。

图1 三种磁珠法核酸提取试剂对某呼吸道病毒荧光PCR结果比较图

2.2 三种提取试剂综合比较。从时间、操作步骤比较，重庆中元核酸提取试剂仅需3步骤、共约10 min完成核酸提取，所需时间最短、步骤最少；品牌B需7个步骤共约20 min完成；品牌C需9个步骤共约30 min完成。综合比较结果可见品牌A总体效果占绝对优势，见表2。

表2 三种磁珠法核酸提取试剂盒总体效果比较

3 讨论

近年来，实时荧光PCR方法依靠其快速、灵敏、特异等技术优点，在MERS、SARS-2、寨卡病毒等新发传染病的快速诊断方面得到了广泛的应用[4-5]。影响荧光PCR检测结果的因素除了引物探针、反应体系等自身内在原因以外，还有一个核酸提取关键影响环节[6]。目前主要的核酸提取方法有滤膜法、磁珠法、trizol法等，各有优势，其中磁珠法易于实现自动化、提取速度快，在新发呼吸道传染病疫情防控和诊疗中得到更为广泛的应用，催生了核酸提取试剂IVD产业的蓬勃发展。为保证检测质量，国务院联防联控发布的医疗机构核酸检测手册（第二版）明确对核酸提取试剂的质量控制要求，在使用前需做好性能验证。

核酸提取试剂盒的性能验证指标主要有回收率和提取纯度测试，如A260/280比值法，通过紫外分光光度计测试的A260/280比值法可以直接计算其加标回收率[7-8]。而对于新发传染病来说，在初期难获得其定标标准物质，在实际检测工作中使用梯度稀释的阳性标本测试不同品牌的核酸提取试剂盒，使用同一品牌的荧光PCR试剂盒测试相应提取产物，比较其检测下限、扩增曲线、时效等参数，可快速评价不同品牌核酸提取试剂盒的效果。在本次A、B、C三家不同品牌核酸提取试剂的测试比对试验中，核酸提取质量是有差异的，品牌A、B、C的提取产物的灵敏度测试依次递减，品牌A仅需10 min分钟即可完成高效提取，且五个稀释梯度均扩增出来，“S”型曲线典型。其快速高效的优势在反应程序上的仅需一步洗涤，其核心的磁珠修饰、裂解液和洗涤液配方的技术创新或改进在当中发挥重要的作用，使去除PCR抑制物、回收的核酸纯度得到很好的保证，比另外两种品牌的磁珠法试剂盒更快速、性能更为优越。因此，在新发传染病的实时荧光PCR检测中，除了关注其技术本身因素外，更应当加强核酸提取试剂的质量评估，保障检测体系的稳定性和准确性。