徐 丹，齐 菲，吴 超，孙野青

（大连海事大学环境科学与工程学院环境系统生物学研究所，大连116026）

免疫磁珠对紫外线引起CD4细胞γ⁃H2AX相对荧光强度变化的影响

徐 丹，齐 菲，吴 超，孙野青∗

（大连海事大学环境科学与工程学院环境系统生物学研究所，大连116026）

针对免疫磁珠技术中磁珠大小对免疫检测结果的影响问题，以三种免疫磁珠为研究对象，分析了单个细胞结合不同大小磁珠的数量情况，利用流式细胞术分析了γ⁃H2AX相对荧光强度变化与辐射剂量的变化关系，探讨了免疫磁珠与细胞结合对紫外线UVC诱发CD4细胞γ⁃H2AX相对荧光强度变化的影响。发现细胞与磁珠比为1∶10时单个细胞至少可以结合一个磁珠，结合数量与磁珠大小有关；UVC辐照引起CD4细胞γ⁃H2AX相对荧光强度变化与辐射剂量呈线性正相关，小磁珠（50 nm）和中磁珠（2.8μm）与细胞结合γ⁃H2AX荧光强度与辐射剂量之间仍具有一定的剂量效应关系，但大磁珠（4.5μm）与细胞结合会导致γ⁃H2AX相对荧光强度与辐射剂量的线性关系不明显。结果可为今后将免疫磁珠用于辐射诱导的DNA损伤评估奠定基础。

免疫磁珠；流式细胞术；UVC；γ⁃H2AX；剂量效应关系

1 引言

免疫磁珠（Immunomagnetic Bead，IMB，简称磁珠）技术是免疫学和磁载体技术结合而发展起来的一项技术，其基本原理是：首先免疫磁珠与抗体结合形成抗体载体；随后磁珠上抗体与特异性抗原物质结合，形成抗原⁃抗体⁃吸住免疫复合物；这种复合物可以在磁力的作用下发生力学移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异性抗原的目的［1］。免疫磁珠由于具有高效、快速、操作简单、生物相容性好等优点，在细胞分选［2］、蛋白提纯［3］、病原体检测［4］等领域都得到了广泛地应用。然而，磁珠的大小是影响此技术成功的关键因素，不同大小的磁珠结合能力、磁力强弱、分离效果及对目的抗原检测的影响都不尽相同，因此，在利用免疫磁珠技术进行免疫检测时有必要探讨最适合的磁珠大小，评价结合效率和特异性。

目前，γ⁃H2AX被公认为是反映辐射引起DNA损伤的生物标志物［5］。组蛋白H2AX在DNA损伤修复中起重要的作用，H2AX磷酸化形成γ⁃H2AX，后者聚集多种修复因子在DNA双链断裂位点，使DNA双链断裂得以修复［6⁃8］。近年来，对γ⁃H2AX的检测方法主要包括免疫荧光法和流式细胞术。与免疫荧光法检测γ⁃H2AX fo⁃ci［5］相比，利用流式细胞术分析细胞内γ⁃H2AX的表达水平具有检测操作简便、快速和高通量等特点，可以排除人为的因素，得到的结果更加客观准确，且γ⁃H2AX相对荧光强度与辐射剂量存在良好的剂量效应关系［9⁃10］。

人外周血淋巴细胞常用来进行辐射损伤检测和风险评估［11］，人CD4＋T淋巴细胞简称为CD4细胞，是T淋巴细胞的一种，表面有CD4分子，属于人体免疫系统中重要的免疫细胞。紫外线辐射是目前诱导DNA损伤最简便有效的方法［12］，本研究利用紫外线（UVC）进行CD4细胞辐照处理，利用免疫磁珠能与CD4细胞特异性结合的特性，采用流式细胞术分析比较三种不同大小的磁珠与CD4细胞结合对紫外线引起γ⁃H2AX相对荧光强度变化的影响，为今后将免疫磁珠技术用于从外周血分离淋巴细胞进行辐射诱导的DNA损伤评估奠定基础。

2 材料和方法

2.1 细胞培养

人CD4＋T淋巴细胞，购自上海复祥生物科技有限公司，悬浮培养于RPMI1640培养液中，外加10%灭活胎牛血清、1%青霉素和链霉素，置于5% CO2培养箱37℃培养，每四天按1∶4传代一次。

2.2 辐照处理

取出CD4＋T淋巴细胞培养瓶，收集培养2天指数生长期细胞，离心去除细胞上清液，然后加入适量PBS溶液，调整细胞浓度为2×106／mL－1，吹打混匀后接种到含有1 mL培养液的60 mm培养皿中，将培养皿放到避光的UVC灯（功率：1100μW／cm2）辐射箱子里，打开培养皿盖子垂直照射，辐照时间为0、2.5 min、5 min、10 min（对应的辐射剂量为0、16 J／m2、32 J／m2、64 J／m2），辐照后盖上培养皿盖子，将培养皿置于5%CO2培养箱37℃恢复培养30 min。

2.3 细胞与磁珠结合

与CD4＋T淋巴细胞结合的磁珠有三种：小磁珠（CD4 Microbeads，50 nm）来自Miltenyi Biotec公司，中磁珠（Dynabeads，2.8μm）和大磁珠（Dynabeads，4.5μm）来自Life technologies公司。由于中磁珠和大磁珠在普通显微镜下可见，因此进行了细胞与磁珠比例为1∶5和1∶10时单个细胞结合磁珠数量的情况分析，随机选取5个视野中的细胞数量，不少于100个，统计单个细胞结合磁珠数量为1、2、3、4及以上的细胞数，分析与未结合磁珠的细胞组相比是否具有统计学意义。

按照操作说明书进行细胞与磁珠的结合，即取适量能与CD4特异性结合的磁珠原液，用PBS缓冲液对磁珠进行冲洗，将辐照处理或未处理的细胞制成单细胞悬液，按照细胞与磁珠比例1∶10，将细胞与磁珠在回旋器上（10 rpm）混合孵育15～20 min，充分结合后进行固定和γ⁃H2AX的荧光标记染色。

2.4 样本固定、荧光标记

利用γ⁃H2AX的荧光标记染色试剂盒（Up⁃state，Catalog＃17⁃344）进行固定和染色，具体操作是取出2×106CD4细胞，加入1 mL的1×Fix⁃ation solution进行重悬；冰上培养20 min固定；用2 mL的1×PBS离心冲洗两次；用1 mL的1×Permeabilization Solution重悬细胞破膜；取出50μL细胞于新的tube管中，加3.5μL的anti⁃phospho⁃Histone H2AX（Ser139）和FITC conjugate（Upstate，Catalog＃16⁃202），冰上培养20 min，并偶尔轻弹；加100μL的1×Wash Solution对其进行冲洗，重悬在450μL的PBS中，转移至流式检测专用管中，用于流式细胞仪检测。实验设定3个重复样品，以单独加入FITC标记的羊抗鼠IgG（二抗阴性对照）和未加任何抗体的空白管（空白对照）作为对照。

2.5 流式细胞仪检测

调整FSC和SSC，选取CD4待测细胞群，以FL1通道获取FITC信号，收集1×104CD4细胞，获取几何平均荧光强度，使用相对荧光强度（实验组几何平均荧光强度／二抗阴性对照的几何平均荧光强度）来反映γ⁃H2AX表达水平。以辐射剂量为横坐标，γ⁃H2AX相对荧光强度为纵坐标，建立剂量⁃效应曲线，线性相关系数R2≥0.95认为线性关系极明显，0.85≤R2＜0.95认为线性关系明显，R2＜0.85认为线性关系不明显。

2.6 统计学处理

实验数据以“均数±标准差”表示，采用SPSS软件包（18.0）进行t检验分析，p∗＜0.05代表有显著差异，p∗∗＜0.01代表有极显著差异。

3 结果与讨论

3.1 UVC辐照引起CD4细胞γ⁃H2AX荧光强度变化

利用UVC辐照CD4细胞，分析γ⁃H2AX相对荧光强度与辐照剂量的剂量效应关系，如图1所示，根据线性回归方程计算线性相关系数R2值为0.922，提示γ⁃H2AX相对荧光强度与辐照剂量具有明显的线性正相关。

3.2 小磁珠与细胞结合对紫外线引起γ⁃H2AX荧光强度变化的影响

由于小磁珠直径仅50 nm太小，因此，在普通倒置显微镜下无法观察到细胞与小磁珠的结合。当小磁珠与CD4细胞结合时，UVC引起γ⁃H2AX相对荧光强度的变化与辐照剂量之间仍具有剂量效应关系，如图2所示，R2值为0.8596，提示γ⁃H2AX相对荧光强度与辐照剂量呈线性正相关。

3.3 中磁珠与细胞结合对紫外线引起γ⁃H2AX荧光强度变化的影响

在普通倒置显微镜下可以观察到细胞与中磁珠的结合，对细胞与磁珠比例为1∶5和1∶10时分别进行数据统计如表1，结果显示两种情况下细胞没有结合磁珠的百分比只占统计总数的12%～13%，细胞与磁珠结合的细胞占统计总数的77%～78%，但结合磁珠数量比例不同。细胞与磁珠比为1∶5时单个细胞结合1～3个磁珠的所占比例较高，而细胞与磁珠比为1∶10时单个细胞结合4个以上磁珠比例增加，具有统计学意义。因此，若从磁珠带动细胞角度上看，中磁珠在细胞与磁珠比为1∶10时在磁场中带动效果会更好。

当CD4细胞与中磁珠结合（细胞与磁珠比为1∶10）时，UVC引起γ⁃H2AX相对荧光强度的变化（见图3）虽然与单纯细胞组相比略降低，但线性相关系数R2值为0.871，提示γ⁃H2AX相对荧光强度与辐照剂量具有一定的剂量效应关系，呈线性正相关。

表1 单个细胞结合中磁珠数量情况分析Table1 Analysisofthenumberofindividualcellscombinedwithmediumbeads

3.4 大磁珠与细胞结合对紫外线引起γ⁃H2AX荧光强度变化的影响

在普通倒置显微镜下可以明显观察到细胞与大磁珠的结合，对细胞与磁珠比为1∶5和1∶10时分别进行数据统计如表2，发现磁珠比例越少，细胞没有结合磁珠的百分比越高，单个细胞结合大磁珠的数量以结合1个磁珠比例最高，分别占42%和38%，具有统计学意义。若从磁珠带动细胞角度上看，大磁珠带动的细胞数太少，不适合在磁场中作为载体带动细胞。

表2 单个细胞结合大磁珠数量情况分析Table2 Analysisofthenumberofindividualcellscombinedwithbigbeads

当CD4细胞与大磁珠结合（细胞与磁珠比为1∶10）时，UVC辐射在高剂量（64J／m2）下γ⁃H2AX相对荧光强度（见图4）与单纯细胞组相比降低明显，导致γ⁃H2AX相对荧光强度与辐照剂量的线性关系不明显，R2值仅为0.78。大磁珠与细胞结合对γ⁃H2AX相对荧光强度的变化影响较大。

4 结论

对于三种不同大小的免疫磁珠与细胞的结合情况，细胞与磁珠比为1∶10时单个细胞至少可以结合一个磁珠，结合数量与磁珠大小有关。中磁珠比大磁珠结合数量多，更适合在磁场中带动细胞，与小磁珠比，中磁珠磁力强，带动细胞的效果会更好。

对于免疫磁珠与CD4细胞结合是否会对紫外线引起γ⁃H2AX荧光强度变化产生影响方面：小磁珠（50nm）和中磁珠（2.8μm）与细胞结合γ⁃H2AX荧光强度与辐射剂量之间仍具有一定的剂量效应关系，但大磁珠（4.5μm）与细胞结合会导致γ⁃H2AX相对荧光强度与辐射剂量的线性关系不明显。由此可以看出，大磁珠与细胞结合对γ⁃H2AX相对荧光强度的变化影响较大，而中小磁珠的影响不明显，可以应用于细胞分离后免疫荧光检测等方面。

目前使用免疫磁珠发展起来的免疫磁性分离技术，具有简便、快速、分离纯度高等优点已被广泛应用于细胞分离、免疫检测、基因工程和靶向释药等领域。此研究为将来此技术中磁珠的选择提供的有力的参考价值，并为今后将免疫磁珠技术用于辐射诱导的DNA损伤评估奠定基础。

（References）

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Effects of Immunomagnetic Beads on UVC⁃induced Changes in Relative Fluorescence Intensity ofγ⁃H2AX in CD4 Cells

XU Dan，QIFei，WU Chao，SUN Yeqing∗
（Institute of Environmental System Biology，College of Environment Science and Engineering，Dalian Maritime University，Dalian 116026，China）

The size of the beads has an impacton the results of the immunoassay in immunomagnetic bead technique.In this study，three kinds of immunomagnetic beads were selected as the research objects.The number of individual cells combined with the beadswas analyzed，the relationship be⁃tween the relative fluorescence intensity changes ofγ⁃H2AX and the radiation dose was studied by flow cytometry，and the effects of immunomagnetic beads on UVC⁃induced relative fluorescence in⁃tensity changes ofγ⁃H2AX in CD4 cellswere discussed.Itwas found that the single cell could com⁃bine at leastone bead when the ratio of cells andmagnetic beadswas1∶10.The number of beads on the cellswas dependent on the size of the beads.UVC⁃induced changes in the relative fluorescence intensity ofγ⁃H2AX were linearly correlated with the radiation dose.In the cases of small beads（50 nm）and medium beads（2.8μm），therewas dose⁃effect relationship between theγ⁃H2AX fluores⁃cence intensity and the radiation dose.While for themagnetic beads（4.5μm）combined with the cells，the linear correlation between the relative fluorescence intensity ofγ⁃H2AX and the radiation dose was not obvious.These resultsmay be helpful for the application of immunomagnetic beads in DNA damage assessment induced by radiation.

immunomagnetic bead；flow cytometry；UVC；γ⁃H2AX；dose⁃effect relationship

R811.5

A

1674⁃5825（2017）01⁃0114⁃04

2016⁃02⁃26；

2016⁃12⁃30

中央高校基本科研业务费专项资金（3132014306）；中国科学院空间科学战略性先导科技专项（XDA04020202⁃12）

徐丹，女，博士，副教授，研究方向为辐射细胞生物学。Email：jotan1995＠dlmu.edu.cn

∗通讯作者：孙野青，女，博士，教授，研究方向为空间辐射生物学。E⁃mail：yqsun＠dlmu.edu.cn