曾赛凡，叶郁红，陈余朋

病理学中的活细胞样本是指将肿瘤细胞以较低密度接种于液体或半固体的培养液中形成悬浮培养的细胞系，对于已培养的活细胞需要转移至玻片上进行染色后镜下细胞形态学观察及细胞性质的鉴定。本实验将活细胞悬液转移至液基固定瓶中进行薄层制片，经HE染色和免疫细胞化学染色检测取得良好效果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料培养子宫内膜癌细胞系ECC-1(培养基PRMI 1640培养液加入10%胎牛血清)，传代培养于培养瓶中悬浮生长，放置离心管中，普通离心机1 500 r/min离心5 min，用无菌的一次性塑料吸管吸取管底沉淀，滴入新柏液基保存瓶中固定静置15 min。

1.2 细胞制片及染色将保存瓶放置新柏液基薄层T2000仪中制片，第一张制片放置95%乙醇中固定10 min,行苏木精淡染评估细胞富集及重叠，若细胞平铺均匀分布就继续制片，若细胞重叠需按倍数稀释固定液，肉眼观察玻片划定区域有灰白色的细胞富集印记，连续制片10张，放置95%乙醇中固定10 min后，从第10张往前推继续淡染苏木精筛查细胞量，选取有细胞量的玻片行HE染色及免疫细胞化学染色。免疫细胞化学指标：鼠单抗CK(AE1/AE3)(1 ∶2 000，福州迈新公司)、p53(工作液，Dako公司)、PAX8(1 ∶1 000，福州迈新公司)，用子宫内膜癌组织切片作阳性对照。采用免疫细胞化学EnVision法染色，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)抗原修复后，直接加入一抗，室温下孵育30 min，二抗10 min，DAB显色3 min，苏木精复染1 min，脱水、透明、封固，显微镜下观察。

2 结果

HE染色镜下观察细胞平铺均匀分布，细胞呈圆形，核质分明，细胞核呈蓝色，核染色质清晰可见，核仁明显，细胞质红色(图1)。免疫细胞化学染色：CK呈细胞质弥漫性棕色阳性(图2)，p53(图3)及PAX8(图4)呈细胞核棕褐色阳性，背景干净。

图1 细胞呈圆形，细胞核呈蓝色，核染色质清晰可见，核仁明显，胞质红色 图2 CK细胞质呈弥漫性棕色，EnVision法 图3 p53细胞核呈棕褐色，EnVision法 图4 PAX8细胞核呈棕褐色着染，EnVision法

3 讨论

活细胞液基薄层制片是通过过滤膜将细胞样本中的细胞进行过滤吸附至膜上，再通过负压作用将滤膜上的细胞转移至带正电荷的玻片上。悬液转移至固定液时在无菌实验室中进行，避免污染对细胞鉴定的影响。液基薄层制片在妇科脱落细胞学样本[1]中已广泛使用，同样在纤维支气管镜刷检标本[2]中也可富集到细胞。本实验也在活细胞样本进行细胞量的收集，对于活细胞悬液直接转移至保存液，细胞固定及时且充分，保证了细胞形态结构的完整；预染观察细胞分布情况是为了更好把握悬液与固定液的混合比例，制作玻片从第10张往前染色是为了检查玻片细胞的富集情况；带正电荷的玻片吸附性强，免疫细胞化学时抗原修复和冲洗不会掉片，活细胞液基薄层制片中无介质参与，无需进行背景消除，抗原渗透充分；形态学观察获得结构清晰和染色鲜艳的细胞以及足够的细胞量后，需用抗原标记以确认是否是内膜肿瘤细胞，可用CK、p53、PAX8作为免疫细胞化学组合进行标记鉴定。文献报道[3-4]用琼脂糖凝集培养细胞制成细胞块切片行染色鉴定获得良好的效果，本实验运用薄层制片同样也可获得均匀平铺细胞富集区域，且形态和抗原性完整的细胞玻片，其步骤简单，收集到的细胞单层、均匀、集中的分布于玻片直径1.5 cm的区域内，指定区域范围可节省活细胞材料，减少阅片面积，缩短阅片时间。直观的从细胞形态学上筛查肿瘤细胞，再结合免疫细胞化学鉴定肿瘤细胞。活细胞液基薄层制片富集培养的细胞获取更多的细胞学前期材料，分子病理学检测有待进一步验证效果。