1，25-二羟维生素D3对川崎病患儿T细胞Wnt信号通路的影响

2021-09-18尚晓麟孟瑞荣王颖

中国生物制品学杂志 2021年9期

尚晓麟，孟瑞荣，王颖

内蒙古医科大学附属医院儿科，内蒙古呼和浩特010059

川崎病（Kawasaki disease）是一种以中小动脉炎症病变为主要病理改变的自身免疫性血管炎综合征，是以全身血管炎症为主要病变特征的小儿疾病［1-2］。1，25-二羟维生素D3［1，25（OH）2D3］的生物活性作用是通过结合和激活其胞内特异维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）实现的［3］。Wnt／β-catenin通路对机体细胞的增殖、分化和凋亡均具有重要调节作用。MicroRNAs（miRNAs）是一类由20~25个核苷酸构成的单链非编码RNA，能够不完全互补于mRNA 3′端的非编码区，从而抑制靶mRNA的翻译或促进靶mRNA的裂解，多种miRNA表达的失调与Wnt密切相关［4-6］。miR-154可使Wnt／β-catenin通路激活，而miR-154对Wnt／β-catenin通路的调控作用在T细胞增殖中的作用尚需进一步研究。

本文就1，25（OH）2D3对T细胞抑制增殖作用的Wnt机制及miR-154的表达进行研究。

1 材料与方法

1.1 样本采集2015年1月—2017年4月在内蒙古医科大学附属医院就诊的川崎病患儿静脉血40份，作为实验组，设对照组（该院体检健康儿童20名）。所有人员均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器1，25（OH）2D3、Facollin液购自美国Sigma公司；1640培养基购自美国Gibco公司；蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；兔抗人Wnt、β-catenin、GAPDH多抗及碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG购自美国CST公司；定量PCR试剂盒（批号：SIGS0002861-1）购自广州锐博生物科技有限公司；ECL试剂盒、酶标仪购自美国Thermo公司；T细胞分离柱、T细胞过滤柱购自美国RD公司。

1.3 外周血T细胞的分离采用T细胞分离柱分离外周血T细胞，将2倍血液体积的Facollin液加至血液中，1 500×g离心15 min；收集中间部分的絮状物，PBS洗涤1次，用2 mL红细胞裂解液裂解红细胞，1 000×g离心5 min；弃上清，将细胞加至T细胞过滤柱中，静置15 min；加入洗液8 mL，800×g离心2 min；收集细胞。

1.4 T细胞的体外培养用含10%胎牛血清的1640培养基37℃，5% CO2培养24 h。

1.5 不同浓度1，25（OH）2D3对T细胞增殖作用影响的检测采用MTT法。制备T细胞悬液，将其加至96孔板中，100 μL／孔，37℃培养；换1次液后，分别加入不同浓度（0、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5μmol／L）1，25（OH）2D3，每个浓度设5个复孔，作用24 h；加入50 μL MTT，作用4 h；弃孔内液体，加入DMSO，100 μL／孔，于酶标仪490 nm波长处测定A值，并按下式计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率（%）=（A药物／A对照）×100%

1.6 实验分组共分为3组。1，25（OH）2D3组：将最佳1，25（OH）2D3浓度作用于川崎病患儿T细胞；川崎病组：川崎病患儿T细胞；对照组：健康儿童T细胞。

1.7 1，25（OH）2D3对T细胞Wnt通路影响的检测采用Western blot法。用总浓度为10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T细胞，分别于0、30和60 min收集细胞，PBS洗涤3次，每管加入含PMSF的裂解液裂解30 min，用蛋白提取试剂盒提取T细胞蛋白。将蛋白样品与等体积上样缓冲液混合，100℃水浴5 min，经12% SDS-PAGE分离后，转移至NC膜上，以GAPDH为内参，加入兔抗人多抗（Wnt：1∶800稀释；β-catenin：1∶600稀释；GAPDH：1∶900稀释），4℃过夜；PBST洗涤2次，每次10 min，PBS洗涤1次，10 min，加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG（1∶2 000稀释），室温振荡孵育1 h；PBST洗涤2次，每次10 min，PBS洗涤1次，10 min，将ECL试剂盒中两种底物液按1∶1比例混合，滴加至NC膜的蛋白面上作用2 min，拍照。试验重复5次。

1.8 1，25（OH）2D3对miR-154表达量影响的检测采用定量PCR法。用总浓度为10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T细胞，分别于0、30和60 min收集细胞，检测miR-154的表达量，具体操作按定量PCR试剂盒说明书进行。miR-154上游引物序列：5′-CACTCCAGCTGGGAATCATACACGGTTGA-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′；引物由广州锐博生物科技有限公司合成。反应条件为：95℃30 s，95℃10 s，60℃30 s，共40个循环。试验重复5次。

2 结果

2.1 1，25（OH）2D3对T细胞增殖作用的影响MTT法检测结果显示，从加入1，25（OH）2D3开始，细胞增殖抑制率逐渐降低，10-3μmol／L 1，25（OH）2D3对T细胞增殖抑制作用最强，为（98.05±0.37）%，见表1。

表1 不同浓度1，25（OH）2D3作用于T细胞24 h的细胞增殖抑制率（%，±s，n=5）Tab.1 Inhibitory rates of T cells treated with 1，25（OH）2D3 at various concentrations for 24 h（%，±s，n=5）

注：a表示与0 μmol／L 1，25（OH）2D3组比较，P＜0.05；b表示与10-1 μmol／L 1，25（OH）2D3组比较，P＜0.05；c表示与10-2 μmol／L 1，25（OH）2D3组比较，P＜0.05。

2.2 1，25（OH）2D3对T细胞Wnt通路的影响Western blot分析显示，川崎病组T细胞Wnt和β-catenin的表达基本无变化，且明显高于对照组（FWnt分别为11.24和14.68，Fβ-catenin分别为13.42和15.17，P均＜0.05）。1，25（OH）2D3作用30、60 min后，Wnt和βcatenin表达明显降低，与川崎病组和对照组相比差异有统计学意义（FWnt分别为12.4和14.6，Fβ-catenin分别为16.1和13.5，P均＜0.05）。见图1和图2。

图1 Western blot分析10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3作用T细胞不同时间Wnt（A）和β-catenin（B）的表达情况Fig.1 Western blotting of expressions of Wnt（A）and βcatenin（B）in T cells treated with 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3 for various minutes

图2 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3作用T细胞不同时间对Wnt（A）及β-catenin（B）表达的影响Fig.2 Effect of treatment of T cells with 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3 for various minutes on expressions of Wnt（A）and β-catenin（B）

2.3 1，25（OH）2D3对T细胞miR-154表达量的影响PCR检测结果表明，加入10-3μmol／L 1，25（OH）2D3后，随作用时间延长，miR-154表达量逐渐降低（F30vs0为12.34，F60vs0为17.14，F60vs30为15.2；P均＜0.05）；而川崎病组miR-154表达量基本无变化，且明显高于对照组（F分别为4.2、3.37和3.14，P均＞0.05）。见表2。

表2 PCR法检测1，25（OH）2D3对T细胞miR-154表达量的影响（±s，n=5）Tab.2 Determination of effect of 1，25（OH）2D3 on miR-154 expression level in T cells by PCR（±s，n=5）

注：a表示与0 min比较，P＜0.05；b表示与30 min比较，P＜0.05。

3 讨论

川崎病是一种常见的免疫性儿科疾病。近年该病发生率呈上升趋势，已取代风湿病成为引起儿童后天性心脏病的主要疾病，严重威胁患者生命安全［7-8］。1，25（OH）2D3的生物活性作用是通过结合和激活其胞内特异维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）实现的［3］。在川崎病治疗中，1，25（OH）2D3具有重要作用。有学者报道将白细胞与1，25（OH）2D3共温育，发现这种激素使杀伤性T细胞失活［7，9-10］。在本研究中，用总浓度10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T细胞后，Western blot分析结果表明，Wnt和β-catenin随时间延长表达量逐渐降低，而miR-154表达量也逐渐降低。表明1，25（OH）2D3对T细胞生长的抑制作用是通过抑制Wnt、β-catenin及miR-154的表达量来实现的。有研究表明，氯化锂对T细胞的细胞周期和细胞增殖有明显的抑制作用，这与抑制Wnt信号传导通路有关［10-12］。本研究发现，1，25（OH）2D3具有与氯化锂相似的作用，为1，25（OH）2D3的进一步研究奠定了基础。