王敏娇 司家文 沈洪洲 游清玲 沈国芳

Foxc2 作为Fox 家族C 亚家族中的一员，在真核生物中十分保守。Forkhead 蛋白在调控胚胎发育、代谢、免疫、应激反应以及分化调控等方面均发挥了重要的作用［1］。Foxc2 初期在小鼠胚胎头部的神经嵴、中胚层来源的间充质细胞以及躯干部的非脊索中胚层中广泛表达，而后在颌面部局限表达［2］。在关键成骨基因过表达或敲除的小鼠中可观察到面部发育异常，同时Foxc2 的表达也有相应的变化［3－4］。本研究拟选取小鼠前成骨细胞系MC3T3⁃E1，通过慢病毒及siRNA 转染改变其Foxc2 表达，明确Foxc2 的功能，并通过基因芯片技术筛查差异表达基因，探索参与相关通路的Foxc2 下游靶基因。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

MC3T3⁃E1 细胞（亚克隆14，中国科学院细胞库），α－MEM 培养基（Gibico，美国），血清（Gibico，美国），胰酶（Gibico，美国），成骨诱导液（Cyagen，美国），甲状旁腺激素（Sigma，美国），辛伐他汀（Sigma，美国），慢病毒载体（上海和元生物），siRNA（上海拓然生物有限公司，中国），实时定量PCR 试剂盒（TaKaRa，日本），PCR 引物（上海生工生物科技有限公司），Foxc2 抗体（Abcam，美国），GAPDH／Runx2 抗体（CST，美国），碱性磷酸酶显色试剂盒（南京碧云天生物技术有限公司）。

荧光定量PCR 仪（ABI，美国），Odyssey 双色红外激光成像仪（LI－COR，美国），表达谱芯片（Agilent，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 MC3T3⁃E1 细胞的成骨诱导培养

以成骨诱导液、甲状旁腺激素（浓度10－8mmol／L）、辛伐他汀（浓度10－8mmol／L）诱导培养MC3T3⁃E1细胞。收集细胞样品，通过后续实验确认Foxc2 表达水平的变化。

1.2.2 慢病毒转染构建Foxc2 稳定过表达MC3T3⁃E1 细胞系

采用慢病毒plenti－Foxc2 及plenti－EGFP 转染MC3T3⁃E1 细胞构建MC3T3⁃E1Foxc2＋（实验组）及MC3T3⁃E1EGFP（对照组）。以2×105个／cm2的密度将MC3T3⁃E1 细胞接种于6 孔板中，次日更换为含5 μg／mL Polybrene 的无血清培养基。……