许洋 王智 孙羽婕 田伟 冯德建 周黎黎

摘要：建立离子色谱法测定绿茶中亚硝酸盐和硝酸盐的含量的方法，茶样前处理方式模拟日常饮茶方式制备茶叶浸提液，依次经过 C18柱、Ag 柱和 Na柱净化，直接进样，采用 KOH 梯度洗脱。亚硝酸盐和硝酸盐工作曲线呈良好的线性相关，相关系数分别为0.9999和0.9992;添加三个浓度水平的加标回收率在96.3%～106.0%之间，精密度测试的相对标准偏差（RSD）值均小于5%。采用该方法对市售46个茶叶进行亚硝酸盐和硝酸盐的检测，结果显示各地所采集的绿茶中亚硝酸盐均存在未检出的情况，检出率和检出含量低。但几乎所有的样品中硝酸盐均检出，且有27.8%茶叶样品硝酸盐含量逼近甚至超过250 mg/kg。

关键词：茶叶;亚硝酸盐;硝酸盐;风险

中图分类号： TS272.7;S571.1文献标志码： A文章编号：1674–5124（2021）12–0058–06

Determination of nitrite and nitrate in green tea and exploration of health risk

XU Yang，WANG Zhi，SUN Yujie，TIAN Wei，FENG Dejian，ZHOU Lili

（Standard and Testing Technology of Tea Key Laboratory of Sichuan Province， National Institute ofMearsurement and Testing Technology， Chengdu 610021， China）

Abstract： An ion chromatography method was established to determine the content of nitrite and nitrate in green tea. In the pretreatment of tea samples， tea extracts were prepared by simulating the way of daily tea drinking. After purification on C18 column， Ag column and Na column， samples were directly injected and then eluted by KOH gradient. There was a good linear correlation between nitrite and nitrate working curves， andthecorrelationcoefficientwas 0.9999 and 0.9992，respectively. Therecoveryratesofthethree concentrations ranged from 96.3% to 106.0%， and the relative standard deviations （RSD） of the precision tests were all lower than 5%. The method was used to detect the nitrite and nitrate in 46 tea leaves sold in the market. The results showed that the nitrite in green tea collected from different places had not been detected， and the detection rate and detection content were low. However， almost all nitrates were detected， and the nitrate content in 27.8% of the samples approached or even exceeded 250 mg/kg.

Keywords： tea; nitrite; nitrate; risk

0引言

全世界有30億人饮茶，茶叶的质量安全问题至关重要。医学研究证明摄入过多的硝酸盐，会对人体健康产生危害[1]，硝酸盐在体内还会转化成亚硝酸盐，会增加患消化系统癌症的几率[2-3]。全球各国采取了一系列相关措施控制食品中亚硝酸盐的含量以及水质中硝酸盐的含量，但却迟迟未给出茶叶和茶饮料相应的限量。有研究表明，茶叶中硝酸盐和亚硝酸盐的含量不足以达到人体的每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）值[4]。但并不意味着我们可以对此安枕无忧，随着茶叶生产中氮肥施用量越来越大[5]，越来越多的茶叶制品（如抹茶、茶粉等）添加在食品中，势必需要制定更高更严苛的质量安全标准来进一步严格把控茶叶质量安全。

目前，有关茶叶中硝酸盐和亚硝酸盐检测方法主要有分光光度法[6-9]和离子色谱法[10-23]。离子色谱法能简便、快速、准确地同时检测硝酸盐和亚硝酸盐。

本文拟建立茶叶中硝酸盐和亚硝酸盐的离子色谱快速检测方法，并利用此方法分析绿茶中硝酸盐和亚硝酸盐污染现状，避免茶叶质量安全问题的盲区，对茶叶中硝酸盐和亚硝酸盐健康风险进行初步评估，希望能为监管部门制定茶叶中硝酸盐和亚硝酸盐限量标准以及采取相关预防控制措施提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

材料：ProElut C18固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

标准品：亚硝酸根离子溶液标准物质 GBW（E）082643;硝酸根离子溶液标准物质 GBW（E）082049;试验采用具有标准物质证书的亚硝酸盐和硝酸盐标准溶液或采用基准试剂进行标准储备液制备。

亚硝酸盐标准储备液：准确称取亚硝酸钠0.1500 g，于110～120℃干燥至恒重，用超纯水溶解并定容至1000 mL，配制成质量浓度为100 mg/L 的亚硝酸盐标准储备液，于4℃下保存，有效期为两个月。使用时根据需要稀释成适当质量浓度的系列标准工作溶液。

硝酸盐标准储备液：准确称取硝酸钠1.3710 g，于110～120℃干燥至恒重，用超纯水溶解并定容至1000 mL，配制成质量浓度为100 mg/L 的硝酸盐标准储备液，于4℃下保存，有效期为两个月。使用时根据需要稀释成适当质量浓度的系列标准工作溶液。

1.2仪器

ICS-2100型离子色谱仪，超声波清洗器， Sartorius BP 211D 型电子天平，Millipore Milli-Q 型超纯水器，0.22?m水性滤膜针头滤器，C18柱、Ag 柱和 Na 柱。

1.3测定方法

1.3.1樣品前处理

茶叶样品烘干粉碎待测，准确称取约2.0000 g       （精确到0.0001 g ）茶叶样品于250 mL 具塞三角瓶中，加入100 mL 新煮沸的超纯水冲泡茶样，摇匀，超声提取30 min，放置5 min 后抽滤，冷却至室温，取15 mL 浸提液过活化过的 C18固相萃取柱，弃去前面3 mL，收集后面流出液待测（若氯离子浓度高于50 mg/L，建议在通过 C18柱后，再通过 Ag 柱和 Na 柱，弃去前面7 mL），最后通过0.22?m水性滤膜针头滤器，供离子色谱仪测定。固相萃取柱使用前按厂家要求进行活化。

1.3.2离子色谱条件

色谱柱：IonPac AS15（4 mm×250 mm ）;流动相： KOH 溶液（免化学试剂）外加水模式;流量：

1.5 mL/min;色谱柱温度：30℃;进样量：50?L。

2结果与讨论

2.1样品前处理条件的优化

本实验前处理方式模拟日常饮茶习惯来制备茶叶浸提液，以便了解在日常饮茶方式下摄取到的亚硝酸盐和硝酸盐的含量，对健康饮茶起到指导作用。由于亚硝酸盐和硝酸盐极易溶于水，选择用沸水进行冲泡提取，随后再用超声提取30 min，让固相充分提取混匀。实验结果表明，亚硝酸盐和硝酸盐的提取很充分，但由于茶叶的成分十分复杂，同时提取出了较多色素、茶多酚、咖啡碱、有机酸等有机成分，需要再引入净化步骤以减少基质干扰。

实验考察了 C18固相萃取柱和活性炭柱对亚硝酸盐和硝酸盐的吸附效果，结果表明，两种固相萃取柱对亚硝酸盐和硝酸盐均没有保留，回收率均良好，但由于亚硝酸盐的出峰时间与氯离子接近，会对亚硝酸盐检测造成影响，而茶叶中亚硝盐酸即便有，含量也很微量，因此为了降低亚硝酸盐的检出限，当样品中氯离子含量过高时，建议再通过 Ag 柱和 Na 柱去除氯离子的影响。以便更微量的亚硝酸盐能被检出。

2.2色谱条件的优化

亚硝酸盐和硝酸盐在常规的阴离子色谱柱上都有很好的保留，但由于茶叶浸提液中小分子的有机酸十分多，且出峰时间很集中，某些小分子有机酸如奎尼酸、乙酸、甲酸等与无机酸会造成与亚硝酸盐的共洗脱[9]，对亚硝酸盐的检测结果造成很大的干扰。

实验考察了IonPac AS11-HC （4 mm×250 mm ）和IonPac AS15（4 mm×250 mm ）两种色谱柱对亚硝酸盐和硝酸盐分离效果的影响，结果表明，IonPac AS15（4 mm×250 mm ）色谱柱由于其疏水性好，因此小分子有机酸与无机离子的分离度比IonPac AS11-HC 效果更好一些，且回收率也较好，因而选择IonPac AS15（4 mm×250 mm ）作为分析色谱柱。

实验还考察了流动相 KOH 溶液浓度对亚硝酸盐和硝酸盐分离效果的影响，结果表明，当 KOH 溶液浓度为20 mmol 时，亚硝酸盐色谱峰附近的干扰很多，呈现堆积出峰的现象，无法达到完全分离，见图1、图2。随着 KOH 浓度的降低，亚硝酸盐与相邻色谱峰之间的分离度逐渐变好，当梯度洗脱起始浓度降为1.0 mmol 时，干扰的小分子有机酸才能够逐一出峰，分离效果最佳，且色谱峰尖锐对称，见图3，图4。综合考虑保留时间、流速、分析时间的因素，最终确定了最优的色谱条件见表1。

2.3方法学验证结果

实验分别进行了方法的线性范围、灵敏度、回收率和精密度考察。

2.3.1方法的线性范围、灵敏度考察

表2结果表明，本测试方法的工作曲线在线性范围内呈现良好的线性相关，并且亚硝酸盐和硝酸盐的色谱峰与相邻色谱峰能够达到基线分离;将系列浓度的对照品标准溶液按照质量浓度由低至高依次注入离子色谱仪分析，采用信噪比法测定亚硝酸盐和硝酸盐的检测限与定量限。信噪比（ signal- noise ratio，S/N）在3左右时对应的质量浓度为检测限浓度，信噪比（S/N）在10左右时对应的质量浓度为定量限浓度，测试结果见表3、表4，亚硝酸盐和硝酸盐的检出限分别为0.2 mg/kg 和0.4 mg/kg，定量限分别为0.75 mg/kg 和2.0 mg/kg ，能够很好地满足茶叶样品中亚硝酸盐和硝酸盐的检测和监管需要，该方法的灵敏度较好。

2.3.2方法的回收率和精密度考察

选取1种绿茶样品进行加标回收试验，称取样品12份，分成4组，每组3份，其中1组作为空白样品，另外3组分别添加1.6 mg/kg、2.0 mg/kg、2.4 mg/kg 3个不同质量浓度的亚硝酸盐标准溶液，同时添加200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg 3个不同质量浓度的硝酸盐标准溶液，每个样品按照本方法进行测定，计算方法的回收率，结果见表5。由表5可知，本方法测定亚硝酸盐的回收率为100.8%～104.2%之间，硝酸盐的回收率为96.3%～106.0%之间，测定结果的相对标准偏差（ rlativesandard deviation，RSD）值均小于7%，说明此方法具有良好的准确度。

选取同一份茶叶样品按照本方法制备供试品溶液，平行制备6份，考察精密度，结果见表6，亚硝酸盐和硝酸盐的测定结果的相对标准偏差 RSD 值均小于5%，表明该方法的精密度好。

2.4健康风险评估

采用本文验证的方法对全国市售46个绿茶中亚硝酸盐和硝酸盐进行检测，最终结果见表7，在46个绿茶样品中，亚硝酸盐整体检出率很低，最高为11.1%，为个别茶样，检出含量范围为未检出（notdetected，ND ）～2.1 mg/kg，各地所采集的绿茶均存在未检出的情况，目前看来不存在食用风险问题。硝酸盐检出率为100%，含量范围为62.01～295.48 mg/kg，硝酸盐含量随绿茶嫩度的降低而升高。目前对于茶叶中亚硝酸盐和硝酸盐均没有限量要求，但茶作为受欢迎的饮料，爱饮茶之人每日摄入，可参照国内外饮用水的限量标准进行健康风险的初步探索，目前各国饮用水的硝酸盐限量普遍为10 mg/L，欧盟最低，为5 mg/L，茶汤若按欧盟对于饮用水中硝酸盐的限量进行折算，则茶叶中硝酸盐含量不高于250 mg/kg 为安全，爱喝浓茶者则对应的安全值还要降低。从本实验结果来看，尽管大部分茶样硝酸盐含量在此安全范围内，但仍然有27.8%样品硝酸盐含量逼近甚至超过250 mg/kg，存在健康风险。

3结束语

本文建立了采用离子色谱法测定茶汤中亚硝酸盐和硝酸盐的检测方法，前处理简单，符合日常饮茶方式，测定结果准确可靠，本实验方法不仅可消除小分子有机酸、色素带来的干扰问题，检出限低，可用于建立标准方法，而且可直观地了解饮茶时真实摄入的亚硝酸盐和硝酸盐含量，帮助进一步制定合理的限量标准。

本实验通过参考饮用水限量对绿茶进行了健康风险的初步探索，部分绿茶硝酸盐存在健康风险，尽管本实验绿茶样本来源较广较随机，且饮茶的习惯和方式各国各地、甚至个人喜好都不同，但可以为茶叶健康风险作出初步的提示，应逐步引起居民和监管部门的关注，全面和深入地开展污染现状研究和健康风险评估，确定有效的检测手段和制定合理的限量标准，推动我国茶产业的高质量发展。

参考文献

[1]张颖琦， 沈俊毅， 徐映如， 等.亚硝酸盐对人体的危害及检测方法的进展[J].职业与健康， 2015， 31（6）：851-855.

[2] LUNDBERG JO， WEITZBERG E，GLADWIN MT. Thenitrate-nitrite-nitricoxide pathwayin physiologyandthera- peutics[J]. NatureReviewsDrugDiscovery， 2008（7）：156-167.

[3]马俪珍， 张健斌， 孟培培.食品中亚硝胺类化合物的危害及控制研究进展[J].鲜与加工， 2012， 12（2）：1-4，45.

[4]王流国， 王雪蒙.减少食品中亚硝酸盐危害的研究进展[J].食品安全质量检测学报， 2016， 7（4）：1593-1598.

[5]袁自春， 杨普， 彭邦发， 等.中国茶叶品质危害因素分析及对策研究进展[J].食品科学， 2013（5）：297-302.

[6]李奕葶， 杨鸿乐， 孙宁， 等.不同浸泡时间对茶叶水中茶多酚及亚硝酸盐含量的影响[J].现代食品， 2020（2）：174-177.

[7]李佳明， 裴红运， 赵文婧， 等.超声萃取-重氮偶合光度法快速检测发酵茶中亚硝酸盐[J].中国茶叶， 2019， 41（5）：28-31.

[8]赵俊英.分光光度法测定饮料中亚硝酸盐的含量[J].山东化工， 2020， 49（18）：74-75.

[9]赵薇.分光光度法测定软饮料中亚硝酸盐的含量[J].化学工程与装备， 2019（1）：259-261.

[10]许东海.离子色谱法同时测定包装饮用水中痕量溴酸盐和亚硝酸盐[J].职业卫生与病伤， 2017， 32（1）：47-50.

[11]任铂.茶叶中亚硝酸盐检测技术分析[J].信息周刊 ，2019（28）：1-2.

[12] ZHOU L， LI H， YE S， et al. A new method for determination offluorideionincommodityteabyion-exclusionchromatography[J]. CyTA-J. Food， 2018， 16（1）：637-641.

[13]吕洁杰， 杜瑞英.茶叶中硝酸盐和亚硝酸盐的研究进展[J].农产品质量与安全， 2020， 108（6）：84-89.

[14] TEMBO Z N， AYGUN F E， ERDOAN B Y. Simultaneous determination of nitrate， nitrite and bromate by capillary zone electrophoresis in tea infusions grown in the Black Sea region of Turkey[J]. Sep Sci Plus， 2020（4）：45-53.

[15] GANZT，YAOT，SHEXS，etal. Simultaneous determination of multiple elements of tea gardensoil using inductively coupled plasma mass spectrometry[J]. IOP Conf Ser： Earth Environ Sci， 2019， 267（4）：042023.

[16]杨启真， 衷明华.氧弹燃烧—离子色谱法测定茶叶中硝酸盐与亚硝酸盐[J].广东化工， 2016， 43（12）：225-226.

[17] DINGQ，CAOL，LIUM，etal. Aunanoparticle-loaded eggshellforelectrochemicaldetectionofnitrite[J]. RSC Advances， 2021， 11（7）：4112-4117.

[18]蒋园园， 程海， 徐蕾.离子色谱法检测地表水中亚硝酸盐含量的研究[J].环境科技， 2018（4）：60-62.

[19]张文婷， 陆秋艳.总膳食中硝酸盐和亚硝酸盐的测定[J].海峡药学， 2018， 30（4）：57-60.

[20]邹沫君， 陈诚.离子色谱法测定包装饮用水中的亚硝酸盐[J].饮料工业， 2020， 23（4）：21-24.

[21]李卓琼， 朴春香.离子色谱法同时测定硝酸盐和亚硝酸盐分析方法的建立[J].化工设计通讯， 2019， 45（6）：90.

[22]陈先森， 李唯一，富玥华， 等.离子色谱同时测定蔬菜罐头中四种阴离子[J].辽宁科技学院学报， 2018， 20（2）：25-26.

[23]陈俊秀， 张秀清， 张瑞雨， 等.离子色谱法同时测定酱油中亚硝酸盐与硝酸盐[J].中国调味品， 2019， 44（11）：171-173.

（編辑：莫婕）