顾泽玮 单友田 陈小雁 蔡冬梅 陈艳蝶 景红娟

摘要：以小麦（Triticum aestivum L.）秋乐2122作为供试材料，以不含硝酸盐的Hoagland溶液为对照，研究不同浓度硝酸盐对小麦根系发育的影响。利用分光光度计和组化染色法检测根尖细胞中O2-·和H2O2含量，并测定细胞内相关氧化还原酶活性与还原型谷胱甘肽（GSH）含量。结果表明，硝酸盐能够显著增加小麦根尖细胞中O2-·而不是H2O2含量;高浓度硝酸盐（60 mmol/L）处理O2-·含量显著高于低浓度硝酸盐（10 mmol/L）处理。低浓度硝酸盐显著降低SOD酶活性和GSH含量，提高POD、谷胱甘肽还原酶（GR）和GSH-PX酶活性，使根部细胞具有良好的抗氧化能力，促进小麦根系生长。高浓度硝酸盐抑制小麦幼苗根系生长，是由于降低SOD与GSH-PX酶活性;虽然增加POD和GR酶活性，但是仍无法缓解根部细胞O2-·过量积累而造成的氧化损伤。所以不同浓度硝酸盐通过调节胞内O2-·含量，实现对小麦根系生长的调控。

关键词：硝酸盐;活性氧;小麦（Triticum aestivum L.）;GSH;根系

中图分类号：S512.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）23-0061-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.014           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

硝酸盐是植物利用的主要氮源，正常情况下土壤中其浓度小于1 mmol/L，但是随着氮肥的大量使用，其浓度可高达70 mmol/L[1]。小麦（Triticum aestivum L.）作为一种典型的单子叶须根系作物，根多、根深、根壮是其高产的基础。小麦根系发育不仅受遗传物质控制，而且生长环境因素也会极大地影响根发育[2]。研究表明，过量硝酸盐会抑制根系生长发育[3]，而缺氮条件在抑制小麦幼苗生长的同时可以刺激根生长[4]。此外，硝酸盐还作为信号分子，通过生长素信号通路调节初生根生长与侧根起始发育[5]。因此，硝酸盐对根系生长发育起关键作用。

植物吸收的硝酸盐在内体还原同化生成游离氨，其通过抑制线粒体内呼吸链的电子传递[5]，诱导生成过量的超氧阴离子（O2-·）[6]，而且O2-·通过超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）酶促歧化生成半衰期更长的过氧化氢（H2O2）[7]。生成的H2O2可在过氧化氢酶（Catalase，CAT）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）作用下生成水分子。O2-·与H2O2作为植物体中主要的两种活性氧（Reactive oxygen species，ROS），低浓度时作为重要信号分子调节根系生长发育[8-11]。还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）通过维持根尖细胞氧化还原平衡，在根尖生长中起关键作用[8]。

硝酸盐通过硝酸转运体进入植物细胞调控根系生长发育[1，4]。但是，硝酸盐调控根系发育是否与ROS有关，鲜见报道。因此，研究不同浓度硝酸盐对O2-·、H2O2含量水平与胞内氧化还原酶活性和谷胱甘肽含量的影响，对阐明硝酸盐作用于小麦根系生长发育的机理有重要意义，也为农业生产中合理施加硝酸盐提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料与培养

材料为冬小麦秋乐2122，购自河南秋乐种业科技股份有限公司。选取子粒饱满，大小均匀，无病虫害的小麦种子，用0.5%次氯酸钠消毒15 min，室温下黑暗萌发24 h，在铺有2层滤纸的培养皿中用去离子水培养1 d后备用。以不含有硝酸盐的改良Hoagland溶液为0 mmmol/L对照，含有10、60 mmmol/L硝酸盐的改良Hoagland溶液为处理继续培养6 d，用于形态和生理指标测定。Hoagland溶液改良配方见表1，在0 mmol/L溶液中为维持渗透和电荷平衡，用Cl-代替处理液的硝酸盐。培养条件为25～20 ℃，光照度4 000～4 500 lx，14 h光照/10 h黑暗。

1.2  测定指标与方法

测定上述培养6 d小麦幼苗的苗长、根长和根数。根部O2-·含量测定采用羟胺氧化法[11]，H2O2含量测定采用钼酸铵法[12]，根尖细胞O2-·与H2O2原位检测分别采用氮蓝四唑（NBT）[13]与3-3′-二氨基联苯胺（DAB）[14]染色法。SOD活性采用NBT光还原法测定，CAT活性采用紫外吸收法测定[15]，POD活性采用愈创木酚法[15]测定。GSH和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量采用A061-1试剂盒测定，GR活力采用A062试剂盒测定，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力采用A005试剂盒测定。上述指标测定均设3组平行，重复3次。

1.3  数据处理

利用Photoshop软件进行图片编辑;利用Origin 8.0软件进行数据计算、统计分析及绘图;采用t检验分析数据的差异显著性。

2  結果与分析

2.1  不同浓度硝酸盐对小麦苗期生长的影响

利用一系列浓度的硝酸盐连续处理小麦幼苗6 d，检测小麦幼苗根长、苗长等形态指标。根据前期试验结果，分别选取10、60 mmol/L硝酸盐进行后续试验。由表2可知，10 mmol/L硝酸盐显著促进小麦幼苗根的生长，其根系长度比对照增加了21%。60 mmol/L硝酸盐对小麦幼苗根的生长有抑制作用，其根长与对照相比降低了8.1%，且苗长也降低了7.9%。但是硝酸盐对根的数量没有显著影响。因此，10 mmol/L硝酸盐显著促进小麦幼苗根系生长，而60 mmol/L硝酸盐则抑制根系生长。

2.2  不同濃度硝酸盐对小麦幼苗O2-·与H2O2含量的影响

适量的ROS作为信号分子，在植物根系的生长发育过程中起关键作用[8-11]。为了探讨不同浓度硝酸盐促进和抑制小麦根系发育的机理，检测了小麦根尖细胞中O2-·和H2O2含量。由图1A可知，O2-·主要位于小麦根尖分生区和伸长区，10、60 mmol/L硝酸盐处理显著增加O2-·含量。图1B结果表明，H2O2含量均匀分布在根尖的各个区域，而硝酸盐处理能够增加小麦根尖分生区细胞H2O2含量。图1C的结果表明，10、60 mmol/L硝酸盐处理的O2-·含量分别比对照提高13.5%和101.7%，即60 mmol/L硝酸盐处理的小麦根尖细胞中O2-·含量比10 mmol/L硝酸盐高。图1B和图1D结果均表明，硝酸盐处理对小麦根尖细胞H2O2含量影响不显著。因此，硝酸盐处理能够显著增加小麦根尖细胞中O2-·含量，而对H2O2含量影响不大。

2.3  不同浓度硝酸盐对小麦幼苗根系氧化还原酶系活性及GSH含量的影响

为了探讨小麦根尖细胞中O2-·含量升高的原因，进一步检测了一系列与ROS代谢相关酶的活性。如图2A所示，与对照相比，10 mmol/L硝酸盐显著降低SOD活性，降低了21.0%。相反，硝酸盐处理能够显著提高POD活性，10、60 mmol/L硝酸盐处理分别提高POD活性11.8%和147.5%（图2B）。由图2C可知，硝酸盐处理对分解H2O2的酶CAT活性影响不大。因此，硝酸盐能够显著提高POD活性，而只有低浓度硝酸盐能够降低SOD酶活性。

谷胱甘肽（GSH）是细胞内重要的氧化还原物质，在维持细胞内氧化还原平衡即内稳态过程中起关键作用[8]。10 mmol/L硝酸盐处理显著降低小麦根尖细胞中GSH含量，而60 mmol/L硝酸盐则显著增加GSH含量，其含量分别为对照的82.2%和131.7%（图3A）。而GSH的氧化形式GSSG在不同浓度硝酸盐处理条件下无显著差异（图3B）。GR是还原性GSH再生的一种关键酶，10 mmol/L硝酸盐和60 mmol/L硝酸盐处理GR活性分别是对照的11.1倍和15.8倍（图3C）。GSH-PX是一种通过氧化GSH降解H2O2的酶，从图3D中可知，10 mmol/L硝酸盐提高GSH-PX酶活性11.2%，而60 mmol/L硝酸盐降低GSH-PX酶活性23.6%。

3  小结与讨论

研究发现，低浓度硝酸盐（10 mmol/L）能够促进小麦根系伸长生长，而高浓度硝酸盐（60 mmol/L）反而会抑制小麦根系生长，再次证明了硝酸盐对根系生长发育的双重作用[3，4]。低浓度硝酸盐能够诱导根部O2-·浓度升高，而一定浓度ROS能够促进细胞壁松弛，有利于细胞伸长生长[14]。高浓度硝酸盐诱导小麦产生大量O2-·，使得细胞内氧化还原动态平衡改变，同时也会引起细胞内物质与结构损伤，最终表现为抑制小麦幼苗生长。

细胞内参与ROS代谢的酶类主要是SOD、POD和CAT[15]。硝酸盐能够显著提高POD活性，却对CAT活性影响不显著，而只有低浓度硝酸盐降低SOD酶活性。SOD可以将O2-·转化为H2O2[7]，其活性降低是硝酸盐诱导O2-·升高的原因之一。硝酸盐诱导O2-·升高势必造成细胞内过氧化物浓度升高，而POD活性升高能够及时消除由于O2-·升高对细胞造成的损伤;同时，POD也是催化H2O2分解的酶，其活性升高也是细胞H2O2含量不变的原因。因此，硝酸盐诱导生成的H2O2主要依赖于POD降解而非CAT。这可能与CAT活性并非仅仅受到底物与产物影响，还受到NADPH氧化酶活性及转录水平调控有关[7]。所以，植物体可能更倾向于维持低H2O2含量状态，以此来保持细胞对H2O2这种信号分子类似于Ca2+的敏感性[16]，使得生长能够对环境的变化快速作出应答。

除了上述参与ROS代谢的抗氧化酶以外，GSH也是调控细胞内氧化还原平衡的重要物质[8]。高浓度硝酸盐可以诱导根部细胞内GSH升高，而低浓度硝酸盐则降低GSH含量，但其氧化型GSSG的含量与对照无差异。因此，高浓度硝酸盐通过上调GSH来维持氧化还原动态平衡，而低浓度硝酸盐则不需要，反而降低了GSH含量。因此，高浓度硝酸盐为了维持较高的GSH含量，通过提高GR活性来实现。进一步证明了GR和GSH通过调节细胞氧化还原平衡，从而调节根的生长[8]。但是，随着细胞内O2-·持续升高，高浓度硝酸盐GSH-PX活性降低，而低浓度硝酸盐GSH-PX活性较高。另外，高浓度硝酸盐增加POD活性，说明除了GSH-PX以外，其他POD是清除升高ROS的主力军。

综上所述，高浓度硝酸盐处理下O2-·大量积累，由于已经超出了细胞内氧化还原体系所能调节的能力，最终表现为抑制生长;而低浓度硝酸盐O2-·适量积累，则是作为信号分子促进了根伸长生长[17，18]。

参考文献：

[1] KRAPP A，DAVID LC，CHARDIN C，et al. Nitrate transport and signalling in Arabidopsis[J].Journal of Experimental Botany，2014， 65（3）：789-798.

[2] TIAN H Y，SMET I D，DING Z J，et al. Shaping a root system：Regulating lateral versus primary root growth[J].Trends Plant in Science，2014，19（7）：426-431.

[3] REP■？魣K M，PALOVE-BALANG P，DU■AIOV？魣 Z K，et al. High nitrogen supply affects the metabolism of Matricaria chamomilla leaves[J].Plant Growth Regulation，2014，73（2）：147-153.

[4] GUO T，XUAN H，YANG Y，et al. Transcription analysis of genes encoding the wheat root transporter NRT1 and NRT2 families during nitrogen starvation[J].Journal of Plant Growth Regulation，2014，33：837-848.

[5] BOUGUYON E，PERRINE-WALKER F，PERVENT M，et al. Nitrate controls root development through post-transcriptional regulation of the NRT1.1/NPF6.3 transporter/sensor[J].Plant Physiology，2016，172（2）：1237-1248.

[6] 景紅娟，李翠香，王俊峰，等.NOXs生成的活性氧对根生长和发育调控的研究进展[J].植物生理学报，2013，49（5）：417-424.

[7] MITTLER R，BLUMWALD E. The roles of ROS and ABA in systemic acquired acclimation[J].The Plant Cell，2015，27（1）：64-70.

[8] YU X，PASTERNAK T，EIBLMEIER M，et al. Plastid-localized glutathione reductase2-regulated glutathione redox status is essential for Arabidopsis root apical meristem maintenance[J].Plant Cell，2013，25（11）：4451-4468.

[9] FOREMAN J，DEMIDCHIK V，BOTHWELL J H，et al. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth[J].Nature，2003，422：442-446.

[10] MONSHAUSEN G B，BIBIKOVA T N，MESSERLI M A，et al. Oscillations in extracellular pH and reactive oxygen species modulate tip growth of Arabidopsis root hairs[J].PNAS，2007， 104（52）：20996-21001.

[11] DUNAND C，CREVECOEUR M，PENEL C. Distribution of superoxide and hydrogen peroxide in Arabidopsis root and their influence on root development：Possible interaction with peroxidases[J].New Phytologist，2007，174（2）：332-341.

[12] TEWARI R K，KIM S，HAHAN E J，et al. Involvement of nitric oxide-induced NADPH oxidase in adventitious root growth and antioxidant defense in Panax ginseng[J].Plant Biotechnology Reports，2008，2（2）：113-122.

[13] 高俊凤.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006.

[14] GILL S S，TUTEJA N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J].Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（12）：909-930.

[15] EVANS M J，CHOI W，GILROY S，et al. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress[J].Plant Physiology，2016，171（3）：1771-1784.

[16] MORGAN M J，LEHMANN M，SCHWARZL？魧NDER M，et al. Decrease in manganese superoxide dismutase leads to reduced root growth and affects tricarboxylic acid cycle flux and mitochondrial redox homeostasis[J].Plant Physiology，2008，147：101-114.

[17] ZHANG M，WANG C，LIN Q，et al. A tetratricopeptide repeat domain-containing protein SSR1 located in mitochondria is involved in root development and auxin polar transport in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2015，83（4）：582-99.

[18] WEI J，ZHENG Y，FENG H，et al. OsNRT2.4 encodes a dual-affinity nitrate transporter and functions in nitrate-regulated root growth and nitrate distribution in rice[J].Journal of Experimental Botany，2018，69（5）：1095-1107.