毕红东 江思瑜 李宝群 苗光新 吴晓光

(承德医学院，河北 承德 067000)

脑出血是指非外伤性脑实质出血，目前治疗的主要入手点为防止占位效应和进一步出血的扩展(如急性溶栓或手术移除血肿等)〔1〕，但是患者的治疗效果不尽人意，严重威胁人类健康，故转变治疗方向意义重大。近年来，随着对脑出血机制的进一步研究，有学者〔2〕提出提高脑出血患者的神经细胞存活度、稳定神经细胞功能或可能成为治疗脑出血的新入手点。补阳还五汤方剂由清代名医王清任始创，是补气活血的良方，具有益气活血通络之功效，在促进神经功能恢复、拮抗脑损伤方面具有一定作用，能够有效治疗半身不遂等病症，分析其作用机制可能与抗血栓、抑制细胞凋亡、减轻钙超载和抗氧化应激及促进神经营养因子表达等多个方面〔3,4〕有关。自噬作为一种决定细胞存活和死亡的新机制在脑出血损伤中扮演重要作用，但尚无补阳还五汤对自噬相关蛋白缺氧诱导因子(HIF)-1α、基质细胞衍生因子(SDF)-1α、趋化因子受体(CXCR)4及其下游通路的研究。本研究主要观察补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织内HIF-1α、SDF-1、CXCR4表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级，雄性，SD大鼠，体重280～320 g(北京维通利华实验动物有限公司，合格证号SCXK(京)2012-0001)。

1.2药物及试剂 补阳还五汤(黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、干地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g)购自北京同仁堂承德分公司；银杏叶片(烟台荣昌制药有限公司，批号140404)。HIF-1α兔抗多克隆抗体(Bioworlde，BS3514)，SDF-1α、CXCR4兔抗大鼠多克隆免疫组化试剂盒，Beclin-1一抗，TUNEL凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为BA1389、BA0761、PB0014、MK1024)。

1.3仪器 双臂数显脑立体定位系统(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，BWSSa907型柔性骨钻(上海软隆科技发展有限公司)，AHB-LB-2型万能研究显微镜(德国莱卡公司)，Ti-u型荧光显微镜(日本尼康公司)，DYCP-35型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.4动物模型制备及分组给药 72只大鼠随机等分为：假手术组、模型组、补阳还五汤组和银杏叶片组。其中模型组、补阳还五汤组、银杏叶片组脑出血大鼠模型采用改良Rosenberg法〔5〕法制备：10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，大鼠顶正中行矢状切口，剥离软组织及筋膜，暴露前囟点和矢状缝。在位于前囟点前2.0 mm，矢状缝右侧旁开3.0 mm处用三棱针钻一直径大约为1.0 mm的小孔。借助立体定向仪利用微量注射器沿钻孔垂直进针6.0 mm，注入大鼠自体动脉血80 μl，留针10 min后缓慢拔针，碘伏消毒手术区后，缝合切口。假手术组仅颅骨钻孔，进针，不注射任何物质。术后24 h，补阳还五汤组、银杏叶片组的大鼠分别灌胃给予26 g/(kg·d)和3.5 mg/(kg·d)，每日1次，共14 d，假手术组及模型组相应灌胃给予等量生理盐水。

1.5蛋白表达及细胞凋亡检测 在末次给药1 h后，大鼠断头取视交叉至大脑横列脑组织，10%甲醛固定48 h，常规石蜡包埋，5 μm厚冠状切片，利用免疫组化法检测HIF-1α、SDF-1α、CXCR-4蛋白的表达变化。采用Western印迹法来检测Beclin-1蛋白的表达变化。采用TUNEL法检测细胞凋亡的变化。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1HIF-1α阳性细胞表达变化 与假手术组比较，模型组脑组织内HIF-1α蛋白的表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组、银杏叶片组的大鼠脑组织HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表1，图1。

表1 补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织 HIF-1α、Beclin-1表达及TUNEL阳性细胞数的影响

图1 补阳还五汤对脑出血大鼠HIF-1α蛋白表达的影响(免疫组化，×400)

2.2细胞凋亡数量的变化 TUNEL阳性表达为呈棕黄色颗粒，位于细胞核。与假手术组比较，模型组血肿周围皮质TUNEL阳性细胞显著增加(P<0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组和银杏叶片组脑组织TUNEL阳性表达显著减少(P<0.05)。见表1。

2.3Beclin-1的变化 与假手术组比较，模型组的Beclin-1蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组、银杏叶片组的Beclin-1蛋白表达均显著降低(P<0.05)。 见表1。

2.4SDF-1α、CXCR4阳性细胞表达变化 模型组、补阳还五汤组及银杏叶片组SDF-1α、CXCR4阳性细胞数均显著高于假手术组，且补阳还五汤组及银杏叶片组阳性细胞数目高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 补阳还五汤对大鼠脑出血后SDF-1α、CXCR4阳性细胞数的影响个/视野)

3 讨 论

中医方面将脑出血归于“中风”范畴，病机关键为元气不足、瘀血阻络，能够对患者预后造成影响的主要因素为治疗方式的选择与脑损伤的程度。脑卒中患者损伤的神经细胞中都出现了明显的自噬现象，这提示自噬激活或是脑缺血损伤早期的一种潜在保护机制；另外，在对大脑出现缺血情况大鼠进行预处理以后，大鼠脑组织的梗死面积显著减少，提示脑组织发生缺血以后神经元细胞的自噬过程能够被诱导，进而启动细胞自身的降解过程〔6〕。本研究结果提示补阳还五汤可通过抑制细胞的凋亡改善脑出血状态。

HIF-1是一种异源二聚体的DNA结合蛋白，其中α亚基定位于胞质并在细胞缺氧时浓度升高，而β亚基定位于胞核且浓度稳定〔7〕。脑组织受内、外力影响而出现阻塞或是破裂时将引起HIF-1α的表达升高，陈锦艳等〔8〕发现在脑出血大鼠模型中HIF-1α水平的升高，其原因可能与脑出血后造成局部脑组织缺血缺氧。本研究结果验证了HIF-1α参与脑出血损伤这一观点。有学者〔9〕证实了HIF-1α参与了小胶质细胞的自噬与凋亡。自噬过度能够加重神经细胞的损伤，3-甲基腺嘌呤(MA)是一种自噬抑制剂，能够加速神经功能的恢复并减小梗死灶的面积；也有学者证实使用含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)抑制剂(一种广谱的抗凋亡药物)治疗减轻脑缺血所致脑损伤程度却相当有限〔10〕，于是人们把目光逐渐转向了自噬。自噬是哺乳动物中自身降解清除、细胞分化重建及调节自身稳态的重要手段，在自噬的过程中有众多的基因参与了自噬的关键过程，其中作为ATG6同系物之一的Beclin-1目前是检测自噬活动的标记蛋白〔11〕，Beclin-1可以调控凋亡相关蛋白磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表达而参与自噬。本研究提示补阳还五汤能够调控HIF-1α表达进而降低Beclin-1蛋白，抑制细胞的自噬。SDF-1α亚型高表达在脑和骨髓等器官中；CXCR4为SDF-1的G蛋白耦联特异性受体，与SDF-1α特异结合后形成SDF-1α/CXCR4轴可以介导炎症反应等。SDF-1α/CXCR4轴可调控血管生成，增加缺氧耐力等机制抑制细胞凋亡发挥修复神经和脑保护作用〔12，13〕，故SDF-1α/CXCR4轴亦可能对细胞自噬状态产生调控。

综上所述，补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织具有保护作用，其机制与HIF-1α调控SDF-1α/CXCR4轴抑制细胞自噬有关。