刘菊 雷映红 陈辉 戴朝博 王志刚 赵晟珣 李琳

(武汉市第一医院老年病科，湖北 武汉 430022)

骨质疏松(OP)是一种以骨量减低，骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特点的全身性骨病。OP性骨折(OF)是OP的严重后果，也是老年人致残、致死的主要原因之一。OP的发病机制十分复杂，是基因和环境共同作用的结果〔1〕。OP受到多方面因素的影响,其中遗传因素占重要作用〔2〕。Klotho基因是与各种衰老表型相关的基因〔3〕。我们前期研究发现，klotho 基因 G395A 位点AA基因型可能是老年男性OP患者的致病基因〔4〕。本研究旨在探讨老年OP患者血清Klotho蛋白水平及Klotho G395-A 基因多态性与OP的相关性。

1 对象与方法

1.1研究对象 本研究随机纳入2018年1月至12月于武汉市第一医院老年病科住院的非OP老年患者50例为非OP组(非OP组)，OP非骨折的患者50例为OP组(OP组)，同期在武汉市第一医院骨科住院的OP的老年患者50例为OP组(OF组)，入选对象均为髋部骨折。患者年龄均≥70岁，均排除严重心、脑、肝肾损害，各种恶性肿瘤、急性感染性疾病、手术、其他应激情况及近期服用影响骨代谢的药物或患有影响骨代谢的疾病的患者。

1.2方法

1.2.1临床资料 人体参数测量，包括体重、身高，计算体重指数(BMI)：体重(kg)/身高(m)2。研究对象空腹、穿单衣、脱鞋去帽，采用统一的工具检测。测量收缩压(SBP)及舒张压(DBP)，采集空腹8 h以上的肘静脉血，用全自动生化仪(型号:Chemray 240，深圳雷杜生命科技公司)检测糖化血红蛋白(HBA1c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等指标。运用ELISIA试剂盒(货号：ZC-31968，zcibio)检测血清Klotho蛋白水平。采用双能X线骨密度(BMD)测定仪，测定髋部T值(T-score)。

1.2.2Klotho基因启动子G395-A 单核苷酸多态性(SNP)检测 用 Taqman 等位基因特异性杂交分析进行SNP分型。采外周静脉血2 ml,3.2%柠檬酸钠抗凝,分离血浆和白细胞,以经典酚-氯仿法提取白细胞基因组,-70℃保存。

根据GENEBANK的KLOTHO基因全DNA序列设计引物，并由武汉谷歌生物科技有限公司合成。预计G-395A扩增产物片段长度为389 bp，上游引物为:TAGGGCCCGGCAGGAT，下游引物为：CCTGGAG-CGGCTTCGTC，FAM 标记探 A:CCCCAAGT-CGGGAAAAGTTGGTC，HEX 标记探针G:CCC-CCAAGTCGGGGAAAGTTGGTC。G-395A的PCR体系：总体积20 μl，上下游引物的浓度均为0.8 μmol/L，探针A和G的终浓度分别为75 nmol/L和250 nmol/L，反应条件:95℃预变性5 min，然后按95℃ 1 min、65℃ 30 s、72℃ 48 s 共40个循环，终末延伸72℃ 5 min，在荧光定量PCR仪上进行扩增。

1.2.3诊断标准 OP的诊断采用WHO(1994年)的诊断标准〔5〕：T值评分，T>-1为骨量正常，-1≤T≤-2.5为骨量减少，T<-2.5为OP，T<-2.5且伴有1处或1处以上骨折为严重OP。

1.3统计分析 采用SPSS20.0软件进行方差分析、LSD-t检验、χ2检验、Spearman相关分析及非条件Logistic回归分析。

2 结 果

2.1临床资料的比较 各组年龄比较，OP组与非OP组比较无明显统计学差异(P>0.05)，而OF组明显高于非OP组和OP组(P<0.05)；OF组男性比例明显少于非OP组(P<0.05)，OP组和OF组BMI和LDL-C、Klotho蛋白水平较非OP组均明显偏高(P<0.05)；OP组和OF组HBA1c较非OP组均明显偏高(P<0.05)，OF组较OP组明显偏高(P<0.05)；各组间SBP和DBP比较无明显统计学差异(P≥0.05)；OP组和OF组BMD较非OP组均明显偏低(P<0.05)，OF组较OP组明显偏低(P<0.05)。见表1。

表1 各组临床资料比较

2.2Klotho G395-A 基因位点分布比较 OP组和OF组AA基因型及A等位基因频率较非OP组均明显升高(P<0.05)；OF组AA基因频率较OP组明显升高(P<0.05)，而A等位基因频率无统计学差异(P>0.05)；3组间AG、GG基因型及G等位基因频率无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 Klotho G395-A基因位点分布比较〔n(%),n=50〕

2.3Klotho蛋白水平、G395-A基因多态性与OF的相关性分析 选择年龄、性别、BMI、收缩压、舒张压、HBA1c、LDL-C、 BMD、血清Klotho蛋白水平及Klotho G395-A基因型等因素与OF进行相关分析，显示OF与年龄、性别、HBA1c及AA基因型频率呈正相关(r=0.159、0.099、0.248、0.389，均P<0.05)，与BMD呈负相关(r=-0.209，P<0.05)；通过回归分析校正混杂因素后，年龄、BMD、AA基因型频率为OF的独立相关因素(OR=1.17、1.43、1.04，均P<0.05)。

3 讨 论

OP是绝经后女性和老年人常见病、多发性疾病，是一种与增龄有关的骨骼疾病。老年骨质疏松(SOP)是70岁以后发生的OP，据调查显示，我国65岁以上人群OP患病率达到32.0%，其中男性为10.7%，女性为51.6%，城市地区为25.6%，农村地区为35.3 %〔6〕。OF是OP的严重阶段，具有发病率及致残致死率高、医疗花费高等特点〔7〕。

OF危险因素众多。BMD减少是OF最重要的危险因素。而种族、年龄、性别、吸烟、低体重指数、缺乏运动、跌倒、绝经年龄、脆性骨折史和骨折家族史、药物影响(如免疫抑制剂、干扰代谢的药物、抗抑郁药、抗凝药、安眠药等)等均为OF重要的危险因素〔8〕。OP发病机制遗传因素占46%～62%，而后天因素占38%～54%〔9〕。Klotho基因是与寿命和各种衰老表型相关的基因，研究发现Klotho基因与动脉粥样硬化、糖尿病、肾损伤、OP等相关〔10,11〕。本课题组前期研究〔4〕发现，klotho G395-A基因多态性与老年男性骨质疏松发病有关，AA基因型可能是老年骨质疏松的致病基因。

在不同人群其klotho基因单核苷酸多态性与骨密度有相关性，提示原发性OP的发生、发展可能与klotho基因表达异常有关。学者研究发现〔12〕，klotho G-395A 基因型与绝经状态相关，绝经后女性GG基因型的BMD明显低于AA基因型，但在绝经前却无显著关联，提示在绝经后女性中klotho G-395A基因型是引发OP的易感基因。西班牙的一项研究〔13〕发现，在年龄33岁的中、青年人群中,FV+W基因型携带者的BMD明显高于FF基因型,证实了klotho基因多态性是影响BMD的遗传因素之一。田小春等〔14〕研究klotho G-395A 基因多态性与原发性OP的相关性过程中，还发现klotho G-395A 基因AA 等位基因型与男性老年人OP相关。

综上，klotho G395-A基因多态性与老年OF有相关性，AA基因型可能是老年OF的易感基因，本研究为老年OF的防治提供理论基础。