段俊, 黄小玲, 刘智鹏, 陈灏文, 林航, 郭嘉亮,*

(1. 佛山科学技术学院 医学院， 广东 佛山 528000； 2. 暨南大学 药学院， 广东 广州 510632)

天然产物是由生命系统产生的化合成分，或者说是由动物、植物、微生物以及海洋生物等产生的特征次生代谢物.天然产物拥有悠久的临床应用历史，与人类的健康密不可分.1806年，德国药剂师弗雷德里希·瑟图纳(Friedrich Sertürner)从罂粟中首次分离出单体化合物吗啡，开创了从天然产物中寻找活性成分的先河；之后，奎宁(Quinine)、青蒿素(Artemisinin)、紫杉醇(Taxol)等具有优异生物活性的天然成分陆续被分离并在临床应用.据统计自1981年至2014年间推出的1562种新批准药物中，有70%以上是来源于天然产物及其衍生物[1].迄今天然产物仍然是新药发掘的重要源泉之一.

天然产物来源广、生长环境差异大，造就了其生物多样性和化学结构多样性；源自不同地区的天然产物，其活性成分和含量均可能存在明显差异.传统活性筛选方法是先对粗提物进行整体药理评价，将活性提取物分成若干组分，再对其有效部位进行分离和纯化得到单一化合物，并逐一验证其生物活性.整个提取分离过程不仅漫长而繁琐，而且使用大量有机试剂不仅与当下绿色发展的生态理念相违背，亦增加了研究成本；同时不同有机试剂之间的交叉作用难免会影响结构不稳定的化合成分，导致其生物活性丧失；此外，一些高活性的微量成分也容易在分离过程中丢失，造成“漏检”.目前仍有大量天然产物，尽管临床疗效明确，但药效物质基础并不清晰.鉴于天然产物本身的多样性和复杂性，其活性成分的分析与研究成为了药物分析研究者高度关注的热点科学问题.随着受体分子构象研究的不断深入，以药物作用靶点为核心的高通量筛选技术，包括计算机辅助虚拟筛选、基因芯片、蛋白芯片等技术，成为了药物发现的有效手段.但是高通量筛选技术必需以单体化合物为研究对象，还是无法离开天然产物复杂的分离纯化过程，严重制约了其在天然产物筛选中的应用.因此，迫切需要开发一种快速灵敏、高效准确的高通量筛选技术，使之能针对性地从天然产物中分离活性成分，同时也能尽量避免漏检.

随着现代医药科学技术的进步，基于生物大分子与配基之间特异性作用的亲和筛选方法，包括亲和超滤、亲和透析、亲和垂钓以及生物亲和色谱柱等被广泛应用于天然活性成分筛选，并且取得了显著的效果.生物亲和色谱柱(bioaffinity chromatographic column，BACC)是将生物大分子(酶、受体蛋白、细胞膜或细胞)通过一定技术手段固定到色谱材料上作为固定相，利用固载的生物大分子对其亲和配基的特异性结合，实现对目标成分的选择性分离的色谱技术[2]，是生物医学与色谱分离技术的有效结合，一定程度上模拟了药物发挥作用的生理过程.目前，生物亲和色谱柱已经被广泛应用到天然活性成分筛选，且部分筛选到的活性化合物已经进入临床研究阶段[3-4]；此外，其在药物与生物大分子之间的相互作用关系，用于阐明复杂的药效学机制的研究也有报道[5-6].生物亲和色谱柱不仅可以从复杂基质中分离出活性成分，减免了繁琐的分离过程及逐一的体外活性测试实验，还可以与气相色谱(gas chromatography，GC)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)、质谱(mass spectrometry，MS)等技术联用实现“高通量筛选，色谱分离和质谱鉴定”一体化，从而提供一种快速、灵敏、安全和高特异性的筛选方法.近年来，生物亲和色谱柱在天然活性化合物筛选中的应用迅速发展，综述对亲和色谱筛选方法进行分类，并结合新技术介绍了其在天然活性化合物筛选中的应用.

1 生物亲和色谱柱筛选原理

生物亲和色谱柱在天然活性成分筛选中的应用包含3种模式，即区带洗脱(zonal elution)，固相萃取(solid-phase extraction，SPE)和固定化酶反应器(immobilized enzyme reactor，IMER).区带洗脱是生物亲和色谱柱最常用的模式，利用生物大分子对化合物亲和力的差异而对不同成分产生不同的色谱保留来实现活性成分的有效分离.天然产物经过亲和色谱柱时，亲和作用弱或者没有亲和作用的成分很快被冲洗下来，亲和作用强的成分后洗脱，从而使活性成分从复杂体系中快速分离.该模式常用于以活细胞、细胞膜、核酸和受体蛋白等为亲和靶标的生物亲和色谱柱筛选.然而，单维生物亲和色谱柱系统分离性能低、检测系统单一(常为紫外检测器)，仅仅依赖化合物与生物大分子之间亲和力的大小很难实现亲和力相近的化合物的有效分离.因此，通常需要联用其他的分析技术对筛选出的组分进一步分离鉴定.

SPE模式是近年来应用于天然产物筛选的另一种模式，其原理如图1所示.天然提取物进入亲和色谱柱中，与固载的生物大分子之间无亲和作用的成分将被淋洗液冲洗下来，而具有亲和作用的成分则被捕获；然后通过洗脱液将捕获的亲和成分从色谱柱上洗脱下来，结合HPLC-MS、GC-MS等技术对洗脱成分进一步分离和结构鉴定.通过与其他高分辨技术的相结合，生物亲和色谱柱技术可作为天然产物化学分析以及生物活性筛选的有效工具.

酶作为生物大分子时，IMER常用于天然产物粗提取物生物活性的快速评价[7].以酶活性为考察依据，将粗提取物与酶特异性底物混合物导入IMER进行酶解反应，利用毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)、HPLC以及MS等技术对酶解效率进行监测(图2).当提取物中存在能够干扰酶对底物酶解作用的成分时，结果表现为酶解产物生成量减少，通过对酶活性改变的检测可以实现提取物生物活性的快速评价.与区带洗脱和SPE模式不同的是，IMER作为一种间接评价方法，仅适用于单一化合物以及提取物整体活性的评价，而无法提供天然提取物中具体特异性配基的相关信息.

2 生物亲和色谱柱固定相的分类

生物大分子的选择是生物亲和色谱柱系统构建的关键步骤.随着对药物作用靶点的认识逐渐增多，越来越多的生物大分子包括蛋白、核酸等被固定到色谱载体材料上用于天然产物中活性成分的筛选.选择生物大分子根据对其特异性的全面认识，原则包括：(1)目标分子和生物大分子之间必须有强的亲和力，通常以解离常数(Km)在浓度为5 mmol/L以下为主；相反亲和力太高也是不利的，因为在解离时所需的条件就要强烈，可能使蛋白质变性；(2)生物大分子必须具有适当的化学连接臂和间隔臂，不参与特异结合，但可用于活化和连接载体.生物大分子通过物理吸附或化学键合固定到色谱材料上作为固定相，根据其所处的微环境不同，本文将生物亲和色谱柱固定相分为生物分子固定相、细胞膜固定相和活细胞固定相.

2.1 生物分子固定相

基于生物分子的生物亲和色谱柱是将脱离细胞或细胞膜微环境的具有一定生物活性的大分子蛋白、核酸等直接固定到色谱材料表面制备成固定相，再利用生物分子对其配基的特异性识别作用实现活性成分的筛选.下面将基于不同生物分子的生物亲和色谱柱展开阐述.

2.1.1 酶

酶是生物体内代谢反应的催化剂，参与生物体的新陈代谢，对生物体的生命活性起重要作用.酶抑制剂作为酶活性调节剂，能够有效调节酶活性，从而调节生物体的生理过程，是临床用于疾病治疗的有效手段.随着固定化酶技术的不断改良，固定化酶稳定性好、可重复使用的优点日渐凸显，逐渐引起天然产物研究者的关注并已成功将其应用于天然产物活性成分的筛选.早期，Reeck课题组[8-9]通过将胰蛋白酶固定到琼脂糖的表面，用于玉米种子提取物中的胰蛋白酶抑制剂的筛选.之后，多种与临床疾病相关的酶，包括血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)[10]，乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)[11-12]，丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase，BChE)[13]，胰蛋白酶[14-15]，α-葡糖苷酶[16]和酪氨酸酶[17]等被固定到各种材料上作为固定相，基于IMERs和SEP模式应用于天然活性成分的筛选研究.

目前，基于IMER的筛选模式已广泛应用于单一化合物库以及天然提取物的筛选研究.Zhang等[16]将α-葡糖苷酶固定到经金纳米粒子修饰的整体基质材料表面而制备固定化α-葡糖苷酶反应器，采用CE对酶促反应进行监测，建立了α-葡糖苷酶抑制剂筛选方法.对11种天然产物提取液的α-葡糖苷酶抑制活性进行测定，最终发现赤芍、丹参、野葛、大黄等提取液均表现出良好的酶抑制作用，揭示了α-葡糖苷酶抑制剂的存在.Min等[11]制备了固定化乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)开管毛细管酶反应器，结合CE对30种天然提取物中AChE抑制剂进行筛选.为了提高筛选的准确性，Vanzolini等[18]将AChE固定化的开管毛细管酶反应器经液相色谱-串联离子阱质谱仪(liquid chromatography-tandem ion-trap mass spectrometer，LC-IT-MS/MS)，建立了在线AChE抑制剂高通量筛选方法.采用MS对酶解产物胆碱的精准定量分析，有效减少假阳性结果的影响.经过已知的AChE抑制剂他克林(tacrine)和加兰他敏(galanthamine)对筛选模型的有效性验证后，该模型被用于香豆素衍生物库中AChE抑制剂的快速筛选，最终从香豆素衍生物库筛选出2种潜在的AChE抑制剂.此外，Vilela等[13]将该方法拓展应用于丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase，BChE)抑制剂的筛选，证实其在抑制剂筛选应用的可行性.

与单靶点药物相比，多靶点药物可同时作用于疾病网络中的多个相关靶点，产生协同作用从而发挥最佳的治疗效果.为了开发多靶点抑制剂的筛选方法，Lin等[19]将同时修饰有腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)的金纳米颗粒通过静电作用固定到毛细管内壁制备了一款双酶反应器(图3).基于酶活性评价对20种天然提取物的酶抑制活性进行快速评价，最终发现青黛提取物具有ADA抑制活性，黄柏、高良姜以及肉桂的提取物具有XOD 抑制活性，而川芎提取物同时存在ADA和XOD抑制活性，揭示川芎中多靶点活性成分存在的可能性.

图3 双酶固定化毛细管微反应器的制备

IMER是用于药物筛选初始阶段的有效工具，可实现粗提取物和单一化合物的生物活性进行快速评价.然而，筛选过程中，其直接研究对象主要是酶的特异性底物或酶解产物而并非活性成分；另外IMER缺乏对活性组分的分离和富集过程而无法直接提供活性成分的相关信息，因此普遍不适用于复杂体系中特定活性成分的研究.

近年来，基于固定化酶的SPE筛选模式也逐渐被应用于天然产物中酶抑制剂的筛选，并通过与HPLC-MS技术联用实现活性成分的结构鉴定.Peng等[20]将修饰有XOD的硅胶填充于钢管柱中制备XOD亲和萃取柱，利用阀切技术将其与HPLC-MS系统联用，搭建了基于SPE模式的在线筛选平台，用于灰毡毛忍冬(Loniceramacranthoides)的水提液中XOD抑制剂的捕获，最终筛选出6种亲和配基，结合色谱图和 MS信息确定化学结构.近来，Wang等[21]以毛细管有机聚合整体材料作为载体制备AChE酶反应器，将其在SPE模式下与HPLC-MS联用，构建了天然活性化合物的在线筛选平台，筛选延胡索提取液中AChE抑制剂，最终得到8个潜在的活性化合物.Lin等[22]以毛细管有机聚合整体材料作为载体制备胰蛋白酶反应器，结合HPLC-MS，成功从中药黄芩的提取物中筛选得到3种潜在的胰蛋白酶抑制剂，即黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷.将固定化酶的固定相并结合色谱/质谱技术的生物亲和色谱柱筛选系统具有效率高、特异性强的优点，是近年来药物研发的研究热点.酶经过固定化处理，可以明显提高酶的储藏稳定性以及对酸、碱、有机溶剂的耐受性，为筛选不同溶解性质的天然产物提供了可能，拓展了其筛选范围.

2.1.2 受体

随着对药物靶点的深入研究，以受体为生物大分子筛选天然活性成分是药物研发的另一思路.近来，有研究报道多受体蛋白生物亲和色谱柱模型用于天然产物筛选.基于药物与受体蛋白之间亲和力的差异，不同成分在色谱柱上会表现出不同的色谱保留特性，从而将活性成分从复杂体系中分离.

在天然产物筛选研究中，β2-肾上腺素能受体(β2-adrenoceptor，β2-AR)筛选模型最为常见[23].作为重要的G蛋白偶联受体之一，β2-AR在心脏和呼吸系统疾病的治疗中发挥重要作用，因而备受研究者的青睐.郑晓晖课题组将β2-AR筛选系统与HPLC-MS技术联用，搭建了离线模式二维筛选平台应用于芍药-甘草汤剂[24]和双黄连方剂[25]中活性成分的筛选，最终成功从芍药-甘草汤剂中筛选出芍药苷和甘草素、双黄连方剂筛选出绿原酸.为了提高筛选效率，该课题组利用阀切技术，将β2-AR筛选模型开与HPLC-MS技术进行整合，开发在线二维筛选平台用于活血胶囊和黄连中β2-AR拮抗剂的筛选[23].相较于离线模式，在线模式可避免收集处理保留成分过程中造成的损失，也缩短了筛选工作时间，提高筛选效率.此外，Calleri等[26]将γ型过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)分别固定于硅胶和毛细管表面作为固定相以建立两种生物亲和色谱柱模型，研究固定化PPARγ对亲和配基的保留特性，为其应用于天然产物筛选奠定基础.

生物大分子与配基之间的特异性作用，使受体蛋白生物亲和色谱柱模型在天然产物筛选应用方面具有选择性高、特异性强的优点.然而，色谱柱寿命短却是阻碍其推广应用的主要因素，特别是β2-AR这种膜受体，受体的制备工艺复杂、膜微环境的缺失使受体蛋白活性改变等，是膜受体生物亲和色谱柱筛选模型推广应用亟需解决的难题.

2.1.3 核酸

核酸控制着生物体细胞的结构和功能，在生命过程中扮演着重要角色，是另一类重要的药物靶点，尤其是用于某些抗癌、抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性药物的筛选.天然产物中的许多生物活性化合物，如姜黄素、金合欢素-7-O-芸香糖苷和槲皮素-3-O-木糖基葡糖苷，能够发挥临床治疗效果主要依赖于它们与DNA的结合作用[27].核酸固定相的开发始于20世纪60年代，固定在各种载体上的具有不同长度的单核苷酸碱基的核酸或寡聚体被应用于多核苷酸和多核苷酸结合蛋白的纯化[28].随着对小分子药物与核酸之间相互作用机制的深入了解，以核酸为亲和靶标的筛选模型也被用于筛选天然产物中活性成分.

Su等[29]将小牛胸腺DNA(calf thymus DNA)固定到氨丙基硅胶表面，制备DNA亲和色谱柱，从黄连和大黄提取液中筛选出DNA亲和配基.通过与online模式的HPLC-MS的联用，最终发现黄连中有小檗碱、巴马汀和药根碱等7种成分，大黄素中有芦荟大黄素、大黄酸和大黄素等14种成分均表现出DNA亲和作用.近年来，基于核酸适配基的亲和技术在蛋白质纯化方面的应用表现出良好的效果，为核酸适配基模型在天然活性成分筛选应用提供思路.

2.2 细胞膜固定相

在已报道的药物作用靶点中，约一半以上为跨膜蛋白[30].将酶或胞质受体蛋白直接用于固定相的制备，不仅提高其稳定性同时又保留其特异性，不失为一种好选择.然而，对于跨膜蛋白来说其耐用性却有待探讨.细胞膜微环境的缺失可能会影响跨膜蛋白的天然构象，从而导致跨膜蛋白活性的丧失或改变.为了有效解决该问题，贺浪冲[31]于1996年首次提出了“细胞膜色谱”(cell membrane chromatography，CMC)的概念，通过细胞膜自身的融合作用以及硅胶表面硅羟基的吸附作用制备成含有目标受体蛋白的细胞膜固定相，最大限度保证了细胞膜的完整性以及跨膜蛋白的三维结构和活性[32].细胞膜固定相的出现可有效弥补生物分子固定相因膜环境的缺失而导致膜蛋白活性改变的不足.不久之后，各种富含药物靶点的组织或细胞系的细胞膜被用于细胞膜固定相的制备，并建立对应的CMC筛选模型筛选天然产物中活性成分[33]，例如，含表皮生长因子受体[34]、血管内皮生长因子受体[35]和成纤维细胞生长因子受体[36]的HEK293细胞膜，含酪氨酸激酶受体的PC-3细胞膜[37]，含L-钙通道受体的血管平滑肌细胞膜[38]，含β1-AR的CHO-S细胞膜[39]，含α1A-AR[40]和α1D-AR[41]的细胞膜等.贺浪冲教授课题组首创的CMC技术不仅在天然药物筛选有广泛的应用，同时也可用于理清药物与其靶点之间的相互作用，这为阐明天然产物的有效物质基础提供了可参考的研究思路.

近年来，随着对药物作用机制的深入研究发现，针对单一靶点的药物在某些治疗疾病时，例如肿瘤、糖尿病、过敏反应等，往往很难达到预期的效果，由此多靶点药物治疗概念应运而生.多靶点药物治疗既可以同时调节疾病网络中的多个环节，又能够降低抗药性的产生，还能对各个靶点产生协同作用，达到满意的治疗效果.Han等[42]将血清免疫球蛋白E(IgE)高表达的RBL-2H3细胞膜和MrgprX2高度表达的LAD2细胞膜混合并固定在活性二氧化硅的表面上，制备双靶点细胞膜固定相，开发了一种双混合CMC筛选模型，通过与(high performance liquid chromatography-electron spray ionization-tandem ion-trap mass spectrometer，HPLC-ESI-IT-TOF-MS)系统联用，鉴定了蛤青注射液中潜在的致敏成分.该双混合CMC模型不仅可以显著提高筛选效率，还为多靶点药物筛选提供了科学依据.

CMC色谱柱寿命较短，迄今仍是该技术的瓶颈.细胞膜通过物理吸附作用附着在硅胶的表面，使用过程中容易出现脱落造成固定相流失，对筛选结果的重现性和准确性有一定的影响.Chen等[43]通过物理吸附方法制备的CMC色谱柱的寿命仅3 d，为了提高细胞膜固定相的稳定性，他们在物理吸附作用的基础上，使用体积分数为4%多聚甲醛对吸附在硅胶上的细胞膜进一步加固[44].经多聚甲醛处理的CMC色谱柱在连续使用6 d后，对阳性药物吉非替尼仍然有较好的色谱保留作用，显然CMC色谱柱的稳定性得到了提高[45].多聚甲醛可以与蛋白质的氨基或羟基反应形成交联，同时能够保持膜蛋白的空间构型，明显提高细胞膜与硅胶结合的稳定性；但是，多聚甲醛作为一种蛋白质交联剂可能会破坏蛋白质的结构使其活性改变，而影响筛选结果的准确性.针对这一问题，Ding等[46]尝试使用经(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES)修饰的硅胶与HepG2癌干细胞膜共价键合制备细胞膜固定相.戊二醛作为交联剂，分别与APTES的氨基和细胞膜表面的氨基进行共价交联，实现细胞膜的共价固定，有效避免细胞膜固定相的流失.经共价键合得到的HepG2/CMC色谱柱的寿命从原来的3 d延长至12 d以上.该方法在提高细胞膜在硅胶表面的附着力的同时又避免了对膜蛋白的破坏，显著提高了CMC色谱柱的稳定性和适应性，适用于难以获得的细胞膜固定相的制备.

Wainer课题组[32]提出了另一种用于膜蛋白固定相制备的方法，细胞膜亲和色谱(cellular membrane affinity chromatography，CMAC),与CMC不同之处在于，经破碎处理提取获得的细胞膜需要进一步溶解于去污剂胆酸盐与正辛基-β-吡喃葡萄糖苷中，然后与固定化人工膜(immobilized artificial membrane，IAM)固定相基质混合，再进行透析除去去污剂和细胞膜脂质，使膜蛋白吸附到IAM基质的表面.IAM是将卵磷脂通过共价键合在硅胶上的一种固定相基质，可以有效模拟细胞膜的微环境，生物亲和性良好，提高膜蛋白的稳定性.目前已报道的大部分nAChR/CMAC色谱柱寿命超过6个月[47]，由Wainer课题组制备的a3β4nAChR/CMAC 色谱柱的寿命甚至可以达到1年[48].以IAM为固定相基质的CMAC色谱柱已被广泛应用于配基-蛋白质相互，复杂基质中活性成分筛选等[49].

Baynham等[48]建立了α3β4nAChR/CMAC-HPLC-MS 在线筛选系统，用于从由7种α3β4nAChR配基和11种非配基组成的18种化合物的混合物中筛选α3β4nAChR亲和配基.在此研究的基础上，分别以表达和不表达α3β4nAChR的HEK293细胞膜制备CMAC (+) 和CMAC (-) 两款色谱柱用于烟草烟雾凝结物中的α3β4nAChR配基筛选[50].保留于两款色谱柱的成分经第二维的HPLC进一步分析，对比样品在经过色谱柱前后的色谱图并基于“missing peak chromatography”原理确定特异性配基.CMAC在研究药物作用机理研究以及药物筛选应用方面已取得一定的研究成果，然而研究者发现当分析对象为亲脂性时，IAM固定相与分析物之间存在非特异性结合，从而造成筛选结果的误断.由此，Moaddel等[30]提出了以开管毛细管制备CMAC色谱柱的方法，通过生物素-亲和素系统将含有大麻素受体(CB1/CB2)的KU-812细胞膜固定在内径为100 μm的毛细管内表面上，用于刺椒提取物中活性成分的筛选，验证了CB1/CB2 亲和配基的存在.

脂筏是细胞膜上富含胆固醇，鞘脂和各种跨膜蛋白例如G蛋白，酪氨酸激酶A(TrkA)受体和内皮素受体的特殊亚结构域，参与细胞的信号转导和蛋白质转运等生理过程.研究表明，脂筏与信号通路、细胞凋亡、细胞黏附和迁移等有关，在抗癌治疗的其关键作用，是近来肿瘤治疗的研究热点[51].在胆固醇存在的情况下，脂筏结构可发生相分离，进而能被非离子去污剂提取.Tong等[52]尝试使用脂筏结构代替完整细胞膜来建立基于脂筏的生物亲和色谱柱筛选模型，将富含酪氨酸激酶A的脂筏结构通过物理吸附作用固定到硅胶表面，制备TrkA脂筏亲和色谱柱，用于天然提取物中抗肿瘤成分的筛选.与传统的CMC色谱柱相比较，TrkA脂筏亲和色谱柱在稳定性方面有明显的提高，使用时长可达30 d[52-53].TrkA脂筏筛选模型筛选中药天南星、王不留行和五倍子中的抗肿瘤成分.结果显示能保留于TrkA脂筏亲和色谱柱的组分具有良好的抑制U251肿瘤细胞生长活性[54].除了与肿瘤发生有关外，脂筏还与阿尔兹海默病、帕金森病、糖尿病、心血管疾病等的发生密切相关，随着现代药理学对脂筏结构的深入探究，将会有更多含有其他特异性受体脂筏模型得以建立并应用于天然产物筛选.

2.3 活细胞固定相

无论是用单一生物分子还是细胞膜来构建筛选模型，都需要经过提取将其从细胞结构中分离，该过程可能会影响靶蛋白原有的性质.相对于生物分子或者细胞膜，以活细胞作为亲和靶标能有效模拟体内药物与其靶点之间的作用，更加真实全面地反映药物的作用机制以确保筛选结果的准确性.目前，已有研究者将活细胞作为亲和靶标固定于各种材料上，开发基于活细胞的筛选策略.Zheng等[55]将人脐静脉内皮细胞固定于经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)三肽修饰的微球材料表面，利用RGD和细胞表面的整合素的特异性作用，制备了活细胞亲和色谱柱；该色谱柱在连续使用14 d内表现出良好的稳定性，并从川芎提取物中筛选出有效成分川芎嗪和3-丁基六氢异苯并呋喃-1(3H)-酮.基于活细胞的生物亲和色谱柱模型相对于其他模型来说能更好地反应生理条件下的药物靶点与其配基之间的相互作用，可特异性筛选出天然产物中的活性成分并提供更准确的生物活性化合物信息，为阐明药物作用机制提供有效的思路和手段，发展前景可观.但是，该模型目前仍面临许多现实挑战，如何有效防止细胞活性的丧失和固定后细胞存活率的下降，是亟待解决的难题.

3 固定化载体材料

载体材料作为生物大分子固定化的载体基质，其自身的属性不仅会影响固定化生物大分子的理化性质，对改善筛选模型的灵敏度和选择性也有一定的作用.天然产物的成分复杂、生物活性化合物浓度低，用于构建天然产物筛选模型的载体材料通常应满足以下几个要求：(1)尽量减少非特异性吸附，避免假阳/阴性结果；(2)不溶于水，但具有一定的亲水性；(3)适宜的孔径和粒径，以提高负载能力和分离效率；(4)良好的渗透新，最好是疏松网状结构，方便大分子自由通过；(5)良好的机械稳定性与化学稳定性，与HPLC系统兼容，尤其是有一定硬度，最好为均一的珠状；(6)随着材料科学的发展进步，多种载体材料已用于琼脂糖、二氧化硅颗粒和整体材料等生物大分子的固定化.

在早期研究中，由于具有pH稳定性、生物相容性好、成本低的优点，一些天然多糖材料，尤其是琼脂糖及其衍生物被广泛应用到生物亲和色谱柱中，用于固定亲和靶标以分离纯化，也有部分用于天然产物中活性成分的筛选.Giudici等[56]采用琼脂糖作为载体，制备胰蛋白酶亲和色谱柱，从向日葵花提取物中分离出一个分子量为16 k的蛋白，经验证该蛋白具有胰蛋白酶抑制活性.

与琼脂糖相比，硅胶具有更好的机械稳定性和更好的传质性能，可实现快速，有效的分离，是迄今为止，生物亲和色谱柱模型构建中最常用的载体材料，尤其在CMC模型的构建.然而，硅胶表面残留的硅羟基能够产生静电、氢键和疏水作用而引起非特异性吸附，对生物亲和色谱柱模型的性能有一定的影响.为此，可采用改性硅胶或者在固定化后进行封端处理的方法来减少非特异性吸附作用[57].Xi等[57]使用表面涂覆壳聚糖层的硅胶颗粒作为胰蛋白酶固定化载体用于鸡蛋清中分离胰蛋白酶抑制剂.将涂覆壳聚糖层的硅胶颗粒和未涂覆的硅胶颗粒分别与鸡蛋清进行孵育，发现未涂覆的硅胶颗粒具有胰蛋白酶抑制剂活性，而涂覆壳聚糖层的硅胶并没有显示出胰蛋白酶抑制活性，说明经过壳聚糖层的涂覆能够有效降低硅胶产生的非特异性吸附.郑晓辉等[58]用甘氨酸乙酯对固定有β2-AR的硅胶封端处理以除去表面未参与反应的咪唑基，减少硅胶的非特异性作用提高受体对配基的特异性和选择性作用.为了提高固定化生物大分子的稳定性，仿生膜修饰硅胶也被应用于膜蛋白的固定化.Li等[59]以卵磷脂修饰硅胶为载体，制备电压依赖性阴离子通道受体亲和色谱柱，用于大黄中抗癌活性成分的筛选.该色谱柱具有良好的稳定性，45 d内连续进样ATP、NADH和NADPH约1 000次而色谱保留没有明显变化.

除硅羟基外，硅胶的孔径和粒径是影响生物亲和色谱柱模型可靠性的另一因素，不仅对生物大分子固定的载量和理化性质有所影响，也会影响色谱性能及筛选结果准确性.Gustafsson等[60]考察了3种不同孔径的(50、60、89 nm)的硅胶对胰蛋白酶固定化效果的影响，结果表明孔径为60 nm的硅胶对胰蛋白酶的负载量最大.Tong 等[53]对比了以3种具有相同孔径(60 nm)、不同粒径(5, 10 和 50 μm)的硅胶基质制备的TrkA脂筏亲和色谱柱对阳性药(来他替尼)的保留行为，结果发现来他替尼在粒径为10 μm或50 μm的TrkA脂筏色谱柱上表现出强烈的保留，而在5 μm粒径的TrkA脂筏色谱柱上几乎无保留，其解释为大粒径硅胶填充的色谱柱在有限的时间内更有利于受体蛋白与配基的充分接触而产生保留.此外，Wang等[61]发现硅胶的粒径会影响EGFR-CMC模型筛选黄芩提取物中有效成分的结果准确性.当使用5 μm的硅胶作为载体基质时，从黄芩提取物中仅筛选到汉黄芩素，而3 μm硅胶基质可以捕获汉黄芩素和黄芩素，而药理实验结果表明汉黄芩素和黄芩素均为活性成分.

除传统的硅胶和琼脂糖外，磁性材料也在生物亲和色谱领域中有所应用.对磁性材料进行化学修饰或生物标记后，生物大分子极易通过共价结合或亲和相互作用吸附于其表面.以功能化磁性材料为载体制备的固定化酶稳定性好, 连续多次使用后仍保留较高的活性，此外，磁性材料的生物相容性好，比表面积大，具有超顺磁性，磁性材料与反应体系利用磁场即可得到快速分离，因此是一种非常理想的固定生物大分子的载体材料.近年来, 有文献报道将蛋白质或酶固定在功能化磁性材料上用于中药活性成分筛选的研究[62-63].

近年，具有良好的渗透性和降低的传质阻力的整体柱材料逐渐得到各个领域研究者的青睐，尤其是在亲和高通量筛选的应用.Hodgson[64]制备二氢叶酸还原酶功能化的硅胶杂化整体柱，在高流速(高达500 μL/min)的条件下，该整体柱仍保持较低的背压，没有造成明显的酶泄露.良好生物相容性和化学稳定性是整体材料的另一优点，可延长生物亲和色谱柱色谱柱的使用寿命.Zhang等[19]以基质整体柱作为α-葡糖苷酶固定化基质，用于11种天然产物中酶抑制剂的筛选.固定化的α-葡糖苷酶在31 d内表现出高稳定性其活性仅下降7.6%，而游离酶在7 d内损失37.7%的活性.整体材料具有通透性好、传质速度快、制备简单、单体种类多和易于改性等优点，在生物亲和色谱柱领域有很好的应用前景，特别是针对天然产物复杂体系的高通量筛选.

4 小结及展望

时至今日，除了筛选天然药物以外，生物亲和色谱柱还被广泛可用于纯化生物大分子、稀溶液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、从纯化的分子中除去残余的污染物、用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配基的生物大分子、分离核酸等方面，应用范围越来越广.生物亲和色谱柱在纯化、富集上，过程简单、迅速，且分离效率高.对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效，具有广阔的发展空间.然而仍存在几个亟待突破的技术局限，包括载体的理化性能、生物大分子的稳定性、整体的使用寿命等等，尤其是其必须针对某一特定分离对象，需制备专一的亲和靶标并寻求分离分析的稳定条件，严重局限了其推广和应用.随着智能设计的迅猛发展，亲和靶标尤其是人工模拟生物大分子的设计将成为可能，也是目前待开发的重要领域，并拓展其简便性和应用面.

作者贡献声明：

段俊：整理参考文献，凝练观点，撰写论文;黄小玲：撰写第三部分固定化材料，整理全文格式;刘志鹏：绘制插图，整理数据，统计分析;陈灏文：论文润色，整理全文格式;林航：论文修改;郭嘉亮：提出思路与框架及论文修改.

利益冲突声明：

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突.