张 亮，向陈艳，袁 红，谭 丽，易建平

（1. 湖南农业大学资源环境学院，湖南 长沙 410128；2. 醴陵市农业农村局，湖南 醴陵 412200）

番茄青枯病是茄科拉尔氏杆菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种严重威胁番茄生产的世界性土传病害，可致番茄产量严重损失以及品质明显降低[1]。该病害广泛分布于热带、亚热带及温带地区，在我国长江以南各地尤其严重，且呈现由南向北蔓延态势，已成为影响番茄等作物生产的最严重病害之一[2]。对番茄青枯病进行传统防控，效果均不理想，且存在危害生态或人体健康等风险，在此背景下，利用有益微生物抑制病原菌为手段的生物防治成为了人们关注的重点。在番茄青枯病的生物防治研究中，已见报道的多为无致病性的有益微生物，诸如多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌等根际促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）[3-5]。根际土壤微生物群落结构的多样性、平衡性是保障作物健康生长的必要条件，土壤病原微生物的长期破坏易致土壤细菌群落特别是有益细菌群落结构和功能多样性不再平衡合理，从而病害频发、作物减产[6-9]。然而，人们对于根际促生菌等有益微生物如何影响青枯病害等逆境下微生物组成和功能多样性演替规律的研究信息尚显匮乏。多粘类芽孢杆菌LRS-1筛选于酸性水稻土壤，并在前期试验中发现对疫霉菌、青枯菌等土传病原菌具有拮抗效果，能够显著降低相关土传病害的病情指数，是优良的生防菌株材料。笔者在此基础之上，对“根际促生菌-番茄-青枯菌-病土壤微生物”的互作效应进行研究，以期揭示土壤有益微生物对病态根际土壤生态调控的微生物互作机制，为保障土壤生物逆境环境下作物的健康生长和土壤生产力的可持续养护提供十分重要的理论价值与现实指导意义。

1 材料与方法

1.1 供试土壤、病原菌与植株

供试土壤为菜园土，pH值5.8，有机质32.76 g/kg，全氮24.3 g/kg，速效磷23.5 g/kg，速效钾134 g/kg，采集于长沙县星港社区居民自种菜地。

供试生防菌为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）LRS-1(以下简称LRS1)，保存于湖南农业大学资源环境学院土壤微生物实验室；番茄青枯菌（Ralstonia solanacearum）为LK1，由湖南农业大学植物保护学院分离与提供。

供试番茄品种为红宝石。

1.2 培养基、试剂盒与引物

细菌NBY培养基配制：营养肉汤粉8 g，酵母提取物2 g，磷酸氢二钾2 g， 磷酸二氢钾0.5 g，葡萄糖2.5 g，1mol/L七水合硫酸镁 1 mL，加去离子水溶解定容至1 000 mL。试剂盒：土壤基因组DNA提取试剂盒（MP Biomedicals公司）。引物：细菌16S rRNA基因通用引物（奥科鼎盛生物科技有限公司）。

1.3 试验方法

生防菌接种方法：泥炭根部包裹法[10-11]。即盆栽前，将生防菌接种于NBY培养基，并在26℃、180 r/min条件下培养48 h，随后经6 000 r/min离心及生理盐水悬浮（109CFU/mL），由辐照灭菌泥炭粉配制成10%（V∶M）生防泥炭（108CFU/mL），备用。

感病土壤制备方法： 接种病原菌在26℃、180 r/min条件下振荡培养于NBY培养基48 h，6 000 r/min离心，生理盐水悬浮（106CFU/mL）后，与过20目筛土壤按1∶10（V∶M）比例混合制备成病土。

盆栽试验：设3个处理，分别为清水对照处理（CK）、青枯菌阳性对照处理（RS）、生防处理（LRS1+RS），各处理20盆（直径12 cm）。试验重复3次。每盆装入300 g病土，移栽1株根部包裹有生防泥炭粉的番茄幼苗（2叶一心），以不接种的灭菌泥炭粉作为阴性对照，常规管理。

样品采集：盆栽试验第30 d时，每个处理随机挑选10盆番茄植株，挖取根系，剥离根外多余土壤，经抖根法用灭菌毛刷收集紧贴根表的土壤于灭菌锡薄纸内，混匀，液氮保存于－80℃冰箱，备用。

1.4 根际土壤DNA提取

试剂盒法提取根际土壤DNA，经0.8%琼脂糖电泳检测，灭菌DERS水稀释至1 ng/μL。

1.5 16S rRNA 基因V3-V4区RSR扩增

以27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）引 物进行RSR扩增。25 μL RSR反应体系包括：5 μL缓冲液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.5 μL引 物（F/R）、0.5 μL DNA模板、0.5 μL聚合酶以及DERS无菌水。RSR运行条件为：94℃ 3 min，30×（94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s），72℃ 10 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。RSR产物纯化后由上海美吉生物科技有限公司进行基于Illumina平台的Miseq测序，完成对16S rRNA基因V3-V4区的检测。

1.6 原始数据处理与分析

原始数据返回后，利用FLASH软件对提出引物序列后的剩余序列进行拼接，并通过QIIME软件进行过滤，与NCBI数据库中已知序列对比分析，经MEGA 7.0软件获得有效序列。随后利用Usearch软件对所有序列进行提取，然后对提取出的fasta文件按照97%相似度水平划分获得物种OTUs，然后利用RDP在线数据库，按照RDP数据库将OTUs进行分类，制作OTU丰度表，并注释OTU系统学分类名称。通过美吉生物云平台分析多样性指数、Venn图、物种群落图、单因素互作网络关系等。

2 结果与分析

2.1 根际土壤细菌OTU多样性

Alpha多样性分析反映微生物群落的丰富度和多样性，其中包括表征群落丰富度的Ace指数和Chao1指数、表征群落多样性Shannon指数以及反映群落覆盖度的指数。如表1所示，CK处理中Chao1指数和Ace指数均为最高，且明显高于其他两个处理，说明阴性对照土壤细菌群落丰富度最高，而RS与LRS1两个处理的土壤细菌群落丰富度下降。Shannon指数以CK处理最高，而RS处理最低，表明阴性对照土壤中细菌群落多样性最大，青枯病阳性土壤细菌群落多样性明显降低，而接种生防菌LRS1则对提高青枯病土细菌群落多样性有益。此外，接种生防菌LRS1有利于提高土壤细菌群落覆盖度。

表1 根际细菌α多样性分析

2.2 根际土壤细菌物种OTUs分布

就OTU水平而言，3个处理共获得5 081个OTU，其中共同含有1 015个OTU。CK处理独有1 026个OTU，LRS1处理1 181个OTU，RS处理独有382个OTU。CK与LRS1共有1 233个OTU，CK与RS共有1 902个OTU，RS与LRS1共有1 387个OTU（图1）。CK处理OTUs总数最高，LRS1与RS处理OTUs总数相近，但以RS处理OTUs最低。上述结果表明，接种生防菌LRS1有利于促进青枯病害胁迫下的根际细菌组成相似性及其细菌种类组成。

图1 根际细菌OTUs分布

2.3 根际土壤细菌群落物种差异

根据各处理根际土壤样本OTU中代表序列的物种注释结果，选取前10名的物种制成相对丰度柱状图。如图2所示，在门分类学水平上排名前十的细菌分别为：放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、浮霉菌门（Planctomycetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、粘孢子门（Myxococcota）等，它们是优势物种类群。不同处理番茄根际细菌的优势菌落在门水平上基本相似，但不同处理间细菌群落的结构与相对丰度存在差异。例如放线菌门（Actinobacteria）在3个处理中相对丰度最高，并且占据着绝对的优势。放线菌门（Actinobacteria）属于细菌中的革兰氏阳性菌群，与人类关系密切，分布广泛，在提高土壤质量与环境保护方面有重要地位。RS处理中放线菌门的相对丰度明显低于其他两个处理。在不同处理根际相对丰度中占据第二大类的变形菌门（Proteobacteria）是细菌中最大的门类，其物种和遗传多样性极为丰富，在土壤生态系统功能中占据着十分重要的位置（图2）。

图2 门水平上的根际细菌相对丰度

如图3所示，就属分类水平上平均丰度大于1 %的根际土壤细菌物种而言，CK处理主要有Xanthobacteraceaev、Micrococcaceae、Oryzihumus、Acidobacteriales、Paenarthrobacter、Gaiellales、Mycobacterium、Nocardioides、Gemmatimonas、Terrabacter、Intrasporangiaceae、Pseudarthrobacter、Methyloligellaceae等，未知细菌约占32.99 %；RS处理主要有Xanthobacteraceaev、Ralstrorinia、Micrococcaceae、Paenarthrobacter、Acidobacteriales、Gaiellales、Mycobacterium、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Candidatus_Solibacter等，未知细菌约占35.16%；LRS1处理主要有Xanthobacteraceaev、Micrococcaceae、Oryzihumus、Acidobacteriales、Ralstrorinia、Conexibacter、Gemmataceae、Paenibacillus等，未知细菌约占38.85%。接种多粘类芽孢杆菌LRS1后，Paenibacillus物种在LRS1处理中物种水平明显提高，占比为2.32%，而病原菌Ralstrorinia物种占比大幅降低。上述结果表明，在青枯病原菌胁迫条件下，接种后的多粘类芽孢杆菌LRS1能够良好定殖于番茄根际土壤，不仅降低了青枯病原菌物种丰度，还对根际细菌多样性起到明显的维持与促进作用。

图3 属水平上的根际细菌群落

2.4 根际土壤细菌群落组成的PCA聚类分析

PCA聚类分析结果显示主成分1（PC1）与主成分2（PC2）对各处理根际土壤细菌群落差异的解释度不同。对照处理（CK）位于PC1负半轴和PC2正半轴，病原菌处理（RS）位于PC1负半轴和PC2负半轴，多粘类芽孢杆菌LRS1处理（LRS1）总体位于PC1正半轴和PC2正半轴，说明各处理间的根际土壤细菌群落变化明显（图4）。

图4 根际细菌群落的PCA聚类分析

2.5 根际土壤细菌互作网络分析

群落互作网络分析结果表明，不同处理间根际土壤细菌群落互作网络复杂程度（图5）、网络异质性（表2）以及网络互作关系（图5）均存在明显差异。与阴性对照（CK）相比，病原菌阳性（RS）处理的网络相似度最低且群落间负面交互作用明显增强，而接种多粘类芽孢杆菌LRS1有利于根际细菌群落互作网络关系的稳定与和谐。

图5 不同处理根际细菌互作网络关系

表2 不同处理细菌生态网络整体性质对比

3 结论与讨论

寻求绿色、安全、高效的生物防治手段对作物土传病害进行防控已成为维护土壤生态和谐与保障土壤肥力发挥的迫切需求[12-13]。此试验中多粘类芽孢杆菌LRS-1从水稻土壤中分离鉴定，该菌株可对辣椒疫霉菌、黄瓜疫霉菌以及番茄青枯菌等多种土传病原微生物产生有效的拮抗防病能力，是研究土壤病害防控的良好材料[14-15]。

根际土壤环境对作物生长具有特殊意义，是作物根系与土壤微生物互作最为密切的微生态圈，该域内各类环境因子、根系分泌物以及微生物群落相互影响、相互制约，从而对作物生长起到其他土壤环境无法比拟的作用[16-17]。根际土壤微生物群落结构的多样性、平衡性是保障作物健康生长的必要条件，土传病害发生严重的土壤受病原微生物的长期破坏导致其土壤中细菌群落，特别是有益细菌群落结构和功能多样性不再平衡合理，导致病害频发、作物减产，不仅严重威胁土壤生态质量状况，而且严重制约农作物种植产业的可持续发展[18-20]。前期试验结果显示接种多粘类芽孢杆菌LRS-1后，该生防菌不仅能力在辣椒根际土壤良好定殖，还对改善辣椒疫霉病害根际土壤微生物多样性具有积极意义[21]。然而，人们对于根际促生菌等有益微生物如何影响青枯病害等逆境下微生物组成和功能多样性演替规律的研究信息尚显匮乏，这是因为外源有益微生物与病态逆境土壤微生物之间，不仅是拮抗菌—病原菌的简单拮抗，还涉及有益功能微生物菌种属性以及与土壤中其他未知土著微生物种群间的竞争、协同等复杂关系[18]。

此研究结果表明，接种生防菌LRS-1不仅能够提高青枯病态根际土壤微生物α指数的丰富度和覆盖度，还能明显降低青枯病原菌物种丰度并利于根际细菌群落多样性的维持稳定。从互作网络分析结果来看，青枯菌阳性对照处理根际细菌负面互作关系明显增加，而接种生防菌LRS-1后整体群落共线性网络趋于稳定，互作关系和谐，这与现有相关报导结论结果相符[22-24]。综上所述，该研究结果为“生防菌—青枯病原菌—病土微生物”体系互作机理研究提供了参考依据，在保障土壤作物健康生长和土壤生产力可持续养护方面具有重要的理论与应用价值。