赵 玉，詹 萍，王 鹏，田洪磊

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119）

猕猴桃（Actinidia），又名“奇异果”，原产于中国，目前主产地为东亚和新西兰。因风味独特，种类众多，营养丰富深受大众喜爱[1-2]。

香气是猕猴桃品质评价的重要指标。迄今为止，猕猴桃中已鉴定出多种挥发性成分，主要包括酯类、醛类和醇类[2]。早在1982年，Shiota通过同时蒸馏萃取分离出猕猴桃中的挥发性成分[3]；之后，研究焦点为贮存条件、成熟度以及加工方式对猕猴桃挥发性成分的影响。如Huan Chen等[4]采用静态顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用法分析不同浓度甲基环丙烯对其品质及挥发性成分的影响；Garcia等[5]分析了不同成熟度与键合态香气成分之间的关系；Chen Yajing等[6]发现猕猴桃汁在500 MPa、15 min条件下，可以减少重要成分己醛和反式-2-己烯醛的挥发。Cozzolino等[7]采用顶空固相微萃取并结合气相色谱-四极杆质谱联用法分析了6 种猕猴桃中挥发性成分差异，并指出戊基呋喃是区分绿心和黄心猕猴桃的关键组分。众多挥发性成分中，只有少数物质对香气轮廓的呈现起决定性作用，这些物质称为关键香气化合物[8]。目前，多种水果中的关键香气化合物已被确定，如桃、杨梅和菠萝蜜[9-11]。然而，猕猴桃香气研究仅局限在挥发性成分分析，对关键香气物质鉴定鲜有报道，因此，本研究将在挥发性成分提取的基础上，进一步鉴定猕猴桃中的关键香气组分。

构建合适的研究方法可提高研究结果的准确性。目前，气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法常用于关键组分的鉴定，利用人灵敏的嗅觉，从复杂混合物中快速有效筛选出贡献较大的目标香气化合物[12]。GC-O分析方法一般包括频率检测法、香气稀释法和直接强度法。与其他2 种方法相比，频率检测法因操作简单、重复性高和节省时间等优点广泛用于分析[13]。此外，一些感官组学研究也用于香气分析如香气活性值（odor activity value，OAV）和香气重组[14]。其中，OAV可用于评价单一组分对整体香气的贡献，一般OAV越大，其贡献率越大[15]；香气重组常用来进一步验证关键香气物质确定的准确性[16]。多种分析方法组合可成功鉴定出食品中的关键香气成分，如荔枝、柑橘和菊花精油[17-19]。因此，本研究将采用HS-SPME法提取分离4 种猕猴桃中的挥发性成分；采用GC-O并结合OAV鉴定关键香气物质；最后通过香气重组进一步验证这些物质确定的准确性。研究将为猕猴桃香气评价以及猕猴桃汁的加工提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用猕猴桃品种分别为美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）翠香（CX）、徐香（XX）和秦美（QM）以及中华猕猴桃（A. chinensis）华优（HY）。当商业采摘期时（可溶性固形物为7～8 °Brix），于陕西周至相同种植园采摘，采摘结束后即刻运回实验室，用于后续分析。选取无任何物理损伤且大小均一的整果于室温下放置至理想可食阶段即可溶性固形物分别达到CX 15～18 °Brix、XX 15～17 °Brix、QM 14～16 °Brix以及HY 13～15 °Brix。然后，将猕猴桃整果清洗并去皮，在低速条件下榨汁，得到猕猴桃果泥，用于后续分析。

正构烷烃（C7～C40）、1,2-二氯苯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、己酸甲酯、己酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、己醛、3-己烯醛、反式-2-己烯醛、辛醛、反式-2-癸烯醛、癸醛、反式-2-壬烯醛、反式-2-己烯-1-醇、己醇、3-己烯-1-醇、1-辛烯-3-醇、4-萜烯醇、柠檬烯、二甲基硫化物和1-戊烯-3-酮标准品 Sigma-Aldrich上海有限公司；氯化钠（分析纯） 上海试四赫维化工有限公司。

1.2 仪器与设备

PL202-L电子天平 梅特勒-托利多上海有限公司；JYZ-V5榨汁机 济南九阳公司；RF15 extech手持折光仪 上海默威生物科技有限公司；手动SPME进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头、7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国Supelco公司；DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；9100嗅闻仪 瑞士Brechbuhler公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME提取

8 g猕猴桃果泥置于20 mL顶空瓶中，同时加入1.6 g氯化钠和1 µL溶于甲醇的内标物1,2-二氯苯（1.306 µg/µL），立即用聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫密封。随后，将顶空瓶置于磁力搅拌器中，于40 ℃平衡20 min，紧接着用50/30 µm DVB/CAR/PDMS萃取头吸附萃取30 min。萃取结束后，立即于GC进样口进行热解吸（250 ℃，5 min）。

1.3.2 GC-MS分析

GC条件：DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；整个过程采用无分流模式，载气为氦气（纯度＞99.999%），流速1.5 mL/min。升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持10 min，再以相同的速率升至220 ℃并保持5 min。

MS条件：电子电离源；质量扫描范围m/z30～450；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃。

定性方式：将化合物的质谱与标准谱库NIST14比对；C7～C40正构烷烃以样品相同升温程序分析，根据正构烷烃结果计算化合物的Kováts保留指数（Kováts index，KI），且与文献值进行比较；KI按式（1）计算；在相同GC-MS程序下，与标准品的保留时间进行比对。

式中：tx为物质x的保留时间/min；tn和t（n+1）分别为n个烷烃碳原子和（n+1）个烷烃碳原子的保留时间/min。

1.3.3 GC-O分析

GC设备上连有9100嗅闻仪，GC-MS条件同1.3.2节。GC流出物以1∶1比例分别进入质谱和嗅闻口。嗅闻传输线为失活且无涂层的熔融二氧化硅毛细管。为防止因长时间嗅闻造成鼻孔干燥，以40 mL/min速率在嗅闻口通入湿

空气。

频率检测法用于GC-O分析，选取8 位有感官评价经验的专业人员组成评价小组，包括4 男4 女，平均年龄在25 岁。为了提高评价人员对猕猴桃气味的敏感性，采用相关的标准品对评价人员进行培训。评价过程中，要求评价人员快速准确地记录气味特征及流出物的开始和结束时间。最终，以每种物质被嗅闻到的总次数作为检测频率（detection frequency，DF），DF不小于4的物质（即8 人中有4 人以上感知到气味信息）视为重要的香气化合物。

1.3.4 定量分析

参照文献[17]的方法，采用标准曲线法进行定量。选取1,2-二氯苯为内标物，用甲醇稀释1 000 倍，4 ℃冰箱保存备用。将GC-O中DF不小于4的香气物质进行准确定量。采用甲醇作为溶剂，将目标化合物与内标物的浓度比配制5 个不同梯度，按照1.3.1节和1.3.2节方法进行分析。以目标化合物与内标物的浓度比为横坐标，以目标化合物与内标物的峰面积比为纵坐标，建立标准曲线，计算香气物质的含量。

1.3.5 OAV计算

查阅化合物在水中的阈值，在定量的基础上按式（2）计算每种物质的OAV：

式中：Cx为物质x的含量/（μg/kg）；OTx为物质x在水中的阈值/（μg/kg）。

1.3.6 感官评价

参考文献[20-21]对重组模型与猕猴桃样本进行感官分析。首先，组织评价人员讨论猕猴桃香气属性；然后，将猕猴桃样品以及GC-O分析中具有典型香气特征的标准品随机编号呈现给评价人员，经过反复讨论筛选直到所有成员对猕猴桃香气属性选择无异议为止；最后，结合相关文献及评价人员讨论结果，最终确定出猕猴桃的5 个代表性香气属性：果香味、青草味、香甜味、黄瓜味以及刺激性气味。这些属性的参照物具体分别为果香味（1.4 µL/L己酸乙酯）、青草味（40 µL/L 3-己烯醇）、刺激性气味（大蒜）、香甜味（蜂蜜）以及黄瓜味（黄瓜）。待感官评价词确定，采用9 分制法进行评价，即0为无此种香气，9为此种香气最强。每个实验重复3 次，取平均值作为最终的感官得分。

1.3.7 香气重组

参考文献[17]，以超纯水为基质，用柠檬酸和蔗糖将基质调节成与4 种猕猴桃具有相同可溶性固形物和pH值的溶液作为模拟体系。然后，将OAV不小于1的香气物质根据定量结果加入到各自的模拟体系中。最后，样品随机编码，进行感官评定，评定方法参照1.3.6节。

1.4 数据处理

采用SPSS 23.0软件分析实验数据，采用Origin 2018软件绘制雷达图。

2 结果与分析

2.1 4 种猕猴桃的HS-SPME-GC-MS及GC-O分析

4 种猕猴桃之间挥发性成分种类及含量差异较大，共分离鉴定出56 种挥发性成分，包括19 种酯、16 种醛、13 种醇和8 种其他类。其中，评价人员通过嗅闻共感知到23 种物质，4 个样本CX、XX、QM和HY分别感知到20、17、18 种和16 种香气化合物，采用标准谱库NIST14、KI及标准品对它们进行定性。

酯类对猕猴桃香气轮廓的形成具有重要作用。从表1可以看出，此类物质主要呈现浓郁的果香和甜香；此外，苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯还具有花香气息。DF值通常可以反映物质在样品中的香气强度[13]。丁酸乙酯在4 个样本中皆呈现强烈的果香味（DF=8），相关研究表明该物质是猕猴桃中的重要香气成分[7,22-23]，与本研究结果一致，推测此物质对猕猴桃香气轮廓的形成起重要作用。同样，己酸乙酯在所有样本中皆被检出，但CX与QM中具有相同的DF值，在HY中DF值最高（DF=8）。丁酸丁酯呈现较高的DF值（DF=6），但它只存在于HY中。苯甲酸乙酯以相同的DF值（DF=4）同时存在于CX和QM中。综上分析，不同品种猕猴桃中重要酯类香气组分的种类及香气强度具有差异性；由于酯类是果香味以及甜香的重要贡献者，因此推测它们之间的差异性是造成不同品种猕猴桃果香味以及甜香不同的重要原因。

醛类是猕猴桃中的一类关键香气物质，根据其香气特征，大致可以分为3 类：青草及绿草味、橘子清香类以及黄瓜香和果香。其中，具有青草及绿草香气特征的物质包括己醛、3-己烯醛、反式-2-己烯醛和反式-2-壬醛。除反式-2-壬醛，这些物质皆为C6不饱和醛，根据文献[24]，它们主要是亚油酸和亚麻酸通过脂肪氧合酶途径生成的。也有研究报道C6醛是猕猴桃中关键风味物质，具有明显的青草气息[2]。特别指出的是，这些C6不饱和醛在4 个样本中都有检出且呈现强烈的青草味，尤其是反式-2-己烯醛在4 个样本中皆具有最高的DF值（DF=8）。此外，呈现橘子清香的物质包括辛醛和反式-2-癸醛，它们只存在于CX和QM样本中，且反式-2-癸醛的DF值比较低。顺,反-2,6-壬二烯醛呈现典型的黄瓜味，此物质已在多种水果中被检出如柿子、西瓜汁和甜瓜[13,25-26]，它存在于所有样本中，可能也是构成猕猴桃香气的重要物质基础。癸醛是唯一呈现果香的醛类，存在于所有样本中。

5 种醇类通过嗅闻被感知到，分别为反式-2-己烯醇、己醇和3-己烯醇（青草味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇味）、4-萜品醇（绿草味，脂味）。其中，己醇在所有样品中都表现出强烈的青草特征，DF值均为8。具有典型蘑菇气味的1-辛烯-3-醇常在水果中被检出如桑葚和西瓜[27-28]，它在CX和HY中具有较强的气味信息。除了酯类、醛类及醇类，有些烯烃类、酮类以及硫化物也对猕猴桃风味的形成起重要作用。柠檬烯具有柠檬香气；二甲基硫醚是唯一一种硫化物，具有刺激性气味，只在XX中检出；与二甲基硫醚相似，1-戊烯-3-酮也呈现刺激性气味，是所有样品中一种重要的香气化合物。

综上所述，多种具有不同香气特征的化合物单体组合形成猕猴桃特定香气，这些物质的存在使猕猴桃风味更加浓郁。为了确定各个物质对猕猴桃香气的贡献程度，本研究将结合OAV分析进一步筛选猕猴桃关键香气物质。

表14 种猕猴桃中GC-O鉴定的香气活性成分（DF≥4）Table 1 Aroma-active compounds (DF ≥ 4) identified in four varieties

2.2 重要香气物质的OAV分析

在精确定量的基础上（表2），进行OAV分析，OAV可用于评价香气化合物对整体风味的贡献。一般，OAV越大对样品贡献越大；当OAV≥1时，该物质可视为关键香气化合物[29]。如表3所示，CX、XX、QM和HY分别有16、15、14 种和13种OAV不小于1的物质。其中，丁酸乙酯在4 种猕猴桃中OAV均最大，分别为737.07、90.54、786.56和581.58，表明此物质对猕猴桃香气的贡献最大，是一种重要的特征风味物质。CX中，苯甲酸乙酯、3-己烯醇和4-萜品醇的阈值分别为60、70 μg/kg和340 μg/kg[27,34,37]，它们因其高阈值致使OAV不大于1。虽然顺,反-2,6-壬二烯醛的含量极少（0.72 μg/kg），但由于极低的香气阈值（0.02 μg/kg），因此它也是CX中的关键香气化合物，对香气轮廓的形成起重要作用。与之类似的还有3-己烯醛、辛醛、癸醛以及反式-2-壬醛均具有低阈值，OAV较高，因此，这些物质也被认为是CX中的关键香气物质。XX中，丁酸乙酯OAV最大，其次丁酸甲酯（48.90），己醇（9.93）和顺,反-2,6-壬二烯醛（26.50）的OAV相对较大，对XX风味轮廓形成同样起重要作用。Bartley等[30]报道一些含硫成分如二甲基硫醚和三硫化物也是猕猴桃中的重要成分。然而，本研究仅发现一种含硫物即二甲基硫醚且将它确定为XX中的关键香气化合物（OAV＞1），这可能是由不同品种及不同产地引起的。QM中，丁酸甲酯（50.49）、顺,反-2,6-壬二烯醛（74.50）和3-己烯醛（34.64）的OAV较大，是QM香气轮廓的重要组成部分。HY中，丁酸乙酯、己醇以及顺,反-2,6-壬二烯醛的OAV较大；己酸甲酯、反式-2-己烯醇以及3-己烯醇的OAV小于1，因此推测这些物质对HY风味轮廓的形成影响较小。综上分析，不同香气物质对猕猴桃香气的贡献程度不同。此外，不同品种猕猴桃关键香气物质具有一定的相似性和差异性，因此造成不同品种猕猴桃风味的普遍性及各自的独特性。

表2 4 种猕猴桃中重要香气成分定量标准曲线及含量Table 2 Quantitative standard curves and mean contents of aroma compounds in four varieties

表3 不同猕猴桃香气成分OAVTable 3 OAV values of aroma compounds in different kiwifruit varieties

2.3 香气重组分析

香气重组是进一步验证关键香气物质鉴定准确性的重要方法[31]。将各样本中OAV不小于1的物质根据实测浓度添加到模拟体系中，形成重组模型。以实际猕猴桃样本作为对照，选取猕猴桃代表性的香气属性（果香、青草味、甜香、黄瓜味以及刺激性气味）作为评价指标，对重组模型进行打分，结果如图1所示。4 种猕猴桃均有强烈的果香和青草香，因此，这2 种香气可看作是它们的主导香气。总体上看，重组模型中这2 种属性的香气强度均稍弱于实际样本，而黄瓜味和刺激性气味则呈现不同的趋势。图1可以直观显示出模拟效果，重组模型与原样本的香气轮廓均具有一定的相似性，表明重组模型成功表现出各猕猴桃样本中的香气，说明成功鉴定出各样本中的关键香气物质，本实验能够从复杂的挥发性成分中快速锁定研究目标，为猕猴桃香气品控提供理论依据。

图1 4 个样本与重组模型香气轮廓对比Fig. 1 Aroma profiles of four samples and reconstitution model

3 结 论

本研究采用GC-O频率检测法和OAV分析并结合香气重组，对不同品种猕猴桃的关键香气成分进行分析。CX、XX、QM和HY通过GC-O各鉴定出20、17、18 种和16 种目标香气化合物。其中，丁酸乙酯在4 种猕猴桃中均呈现强烈的果香味。此外，C6不饱和醛和醇呈现典型的青草味。CX、XX、QM和HY中OAV大于1的特征香气成分各有16、15、14 种和13 种，共有关键组分为丁酸乙酯、己酸乙酯、C6不饱和醛、癸醛、反式-2-壬醛、顺,反-2,6-壬二烯醛、己醇、1-辛烯-3-醇和1-戊烯-3-酮。除上述物质外，丁酸甲酯、己酸甲酯、苯甲酸甲酯、辛醛、反式-2-己烯醇也是CX中的关键香气物质；丁酸甲酯、3-己烯醇、柠檬烯和二甲基硫醚也为XX中的关键香气物质；同样，丁酸甲酯、己酸甲酯和辛醛确定为QM中的关键香气物质；丁酸丁酯和柠檬烯为HY中的关键香气物质。本研究成功确定出4 种猕猴桃中的关键香气成分，可为猕猴桃品质调控提供参考。