张正英 崔乃元 王云平 张汉青 赵维章 马立才*

1.青海省动物疫病预防控制中心 810001

2.北京维德维康生物技术有限公司 100095

牦牛是青海省优势畜种之一，是十分宝贵的畜种资源，被誉为“高原之舟”。青海省现存栏牦牛481 万头，占全国牦牛总数的34.6%，能繁母牛240 万头，年出栏牦牛14.6 万头，年产牦牛肉13.2 万吨，牦牛市场前景不可估量。在牦牛饲养生产过程中，四环素类药物作为一种广谱抗生素，是疾病治疗的常用药，主要将其用于细菌感染性疾病的预防和早期治疗，容易导致四环素以残留进入人体或生态系统，给动物源性食品带来严重的安全问题。

目前检测动物组织中四环素的方法较多，国内外的残留检测方法主要有LC-Q-TOF 和LC-MS/MS 等方法。色谱法和质谱-色谱联用法等仪器法的灵敏度和准确度较高，有些方法的灵敏度能达到0.1ng/g，一般为确证方法，但仪器昂贵、样品前处理复杂和需要专业技术人员操作，分析成本高，不适用于基层实验室的大规模样本检测。

但是目前为止，还没有应用时间分辨免疫层析技术检测青海牦牛中四环素药物残留的报道。本研究以青海牦牛肉作为研究对象，采用荧光定量免疫层析检测方法，对牦牛肉中四环素类药物残留进行检测，并用高效液相色谱法对时间分辩荧光定量免疫层析检测结果进行评价对比分析，以便找到牦牛肉中四环素残留量的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验样品牦牛肉样品由青海主月畜牧业有限公司、青海夏华肉食品有限公司、青海裕泰肉食品等公司提供。

1.2 实验仪器立式高速冷冻离心机（湖南湘仪HR/T20MM），电子天平（梅特勒XS204DR），微量移液器（德国Eppendorf），德国超纯水机（德国密尼博纯水机），固相萃取小柱（WatersHLB型，60mg，3mL），pH 计（上海雷磁ZD-2A 型），检测卡恒温孵育器、时间分辨荧光免疫定量分析仪（北京维德维康），高效液相色谱仪（美国Agilent1100，配PAD 二级阵列管检测器）。

1.3 化学试剂甲醇、乙腈、磷酸氢二钾、盐酸、氢氧化钠、吐温20、乙酸乙酯、正己烷；四环素标准品（纯度≥96%）美国Sigma 公司。

1.4 实验方法

1.4.1 时间分辨荧光免疫定量分析法

1.4.1.1 样品前处理 样品前处理：称取1.00±0.02g 匀质后的样品于10ml 离心管中，加入2ml 样品提取液、350ul 体系调整液，剧烈涡动1min，4000g 离心5min，上清备用。

1.4.1.2 样品测定 实验前，将检测卡和金标微孔平衡至25℃，吸取200ul 离心上清液于金标微孔中，小心吹打至孔底的紫红色颗粒完全溶解，室温（25±2℃）孵育3min，取120ul 金标微孔中样品滴加到加样区并开始计时，准确反应10min 后，插入荧光免疫定量分析仪读数。

1.4.1.3 标准曲线及检出限 根据维德维康公司提供四环素类药物标准溶液，浓度分别为：0.0μg/kg，5.0μg/kg，10.0μg/kg，20.0μg/kg，40.0μg/kg，80.0μg/kg，160μg/kg，选取仪器测试四环素阴性样本20 份，采用时间分辨荧光免疫层析方法进行测定，分别得到20 次结果的均值和相对标准偏差（SD），其平均值加上10 倍标准差，即为检测限（LOQ），结果见表1。

表1 两种检测方法标准曲线方程及相关系数

1.4.1.4 准确度与精密度测试 在牦牛肉样品中添加浓度为10μg/kg、20μg/kg 和80μg/kg 四环素药物标准溶液，平行添加3 份，用荧光免疫定量分析仪测试，回收率及变异系数见表2。

表2 加标回收及RSD 值

1.4.2 方法学比较取30 份牦牛肉样品，分别采用时间分辨荧光免疫层析定量分析法和GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留检测方法》液相色谱-质谱/质谱法进行检测，并对两种方法检测结果的一致性进行分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与检出限

高效液相色谱法配置四环素标准溶液浓度梯度为0.05、0.1、0.20、0.50、1.0 mg/kg，每个浓度点进行5 次平行实验，由仪器用平均值绘制标准曲线，得到A=12.15c+65.37，相关系数为0.991 的标准曲线，以3 倍信噪比计算四环素的检出限为0.05mg/kg。

时间分辨荧光免疫层析法，北京维德维康生物技术有限公司提供标准曲线的线性区间（IC20～IC80）为9.65～81.25μg/kg，线性相关性R2为0.9813，通过测试结果表明，四环素检出限为10μg/kg，定量范围为10～80μg/kg。

2.2 准确度和精密度

由表2 可知，高效液相色谱法在牦牛肉样品中添加20ng/ml，40ng/ml，60ng/ml 3 种浓度的四环素标准对照品溶液后，通过仪器进行加标回收实验分析，平均回收率在87～106%之间。

时间分辨荧光免疫层析法，在空白牦牛肉样品中添加3 种浓度的四环素类药物标准溶液，添加浓度为10μg/kg、20μg/kg 和80μg/kg，所有样品各添加浓度的回收率均在80～120%之间。

2.3 免疫层析方法（定量）与高效液相法测定结果比较选取经液相色谱法和时间分辨免疫层析法同时测定的10份牦牛肉阴性样品，同时进行加标实验，同时每5 个样品添加同一个标准梯度，分成2 组添加样品，采用两种测试方法进行定量检测，检测结果见表3。

表3 两种测试方法结果比较 单位：mg/kg

本实验应用时间分辨免疫层析法和LC-MS/MS 方法进行确认比较来检测青海牦牛肉中四环素药物，由表3 可知，两种方法对四环素药物检测结果一致性较高。

3 结 论

本实验通过采用时间分辨荧光免疫层析方法来检测青海牦牛肉中四环素残留量，定量限为10μg/kg，添加平均回收率80.0～120.0%之间，平均RSD 值为11～15%，该方法可在30 min 内完成样本的前处理，10min 完成定性定量检测，肉眼视觉直接判断阴阳性（定性），通过仪器识别内置二维码直接显示检测四环素药物残留含量，通过加标回收与高效液相色谱法进行方法确认，结果表明实验结果一致性高。

由此说明，本研究的牦牛肉中四环素药物残留检测方法的准确度、精密度、灵敏度均较高，可用于牦牛肉中四环素药物的实际检测，加之时间分辨荧光免疫层析方法操作简单，容易上手，检测成本低，对实验室基础设施要求不高，很容易在基层实验室中推广使用，可实现牦牛养殖过程中任何环节的四环素药物残留检测，比如在牦牛养殖环节、屠宰环节、销售环节均可实现四环素残留检测，并建立数据库，为实现青海牦牛肉质量追溯体系的建设提供数据支撑。