刘向楠 丛锋 关剑池 刘贤旭

1.广东科贸职业学院动物科技学院 510430

2.广东省实验动物监测所 510000

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起多种禽类发生感染和死亡的一种重要动物疫病，严重危害世界养禽业发展和公共卫生安。目前，血凝抑制和酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测是实验室检测AIV 抗体的主要技术方法。但是，血凝抑制试验1%红细胞悬液的制备需要新鲜配制和保存，结果判读主观性较强。ELISA 试剂盒成本较高，无法实现多重抗体检测。而本研究采用的液相蛋白芯片技术（Flexible Multi Analyte Profiling，xMAP）作为一种新型的高通量检测技术，具有多重检测和灵敏度高的技术优势，已普遍用于实验动物疫病抗体检测，在畜牧兽医领域研究较少，尚未商品化应用。

本研究建立了检测AIV 抗体的xMAP 检测方法，丰富了AIV 检测技术方法，具有解决临床上高通量抗体检测的潜力，为禽流感的诊断、检测及防控提供了一种新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 试剂禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H2N2核蛋白（Nucleoprotein，NP 蛋白）购自广州千寻生物技术有限公司。马立克病毒（Marek's disease virus，MDV）阳性血清、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）阳性血清、AIV 阳性血清、SPF 鸡血清购自哈尔滨维科生物科技有限公司。传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）阳性血清、传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）阳性血清、传染性喉气管炎（Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV）阳性血清购自中国兽医药品监察所。禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）阳性血清为哈尔滨国生生物有限公司的禽白血病抗体ELISA 试剂盒中阳性对照品。28 份临床鸡血清采集自广东惠州某养鸡场。

生物素标记的兔抗鸡IgG 购自Solarbio 公司，藻红蛋白标记的链霉亲和素（SAPE）购自Invitrogen 公司。xMAP 磁珠购自Luminex 公司。禽流感ELISA 抗体检测试剂盒购于西班牙海博莱公司。

1.2 仪器液相芯片检测系统Luminex 2000，涡旋振荡仪，超声仪，摇床，磁力板等。

1.3 蛋白抗原性分析按经验值将NP 参考蛋白偶联试剂盒说明书偶联到xMAP 磁珠，蛋白浓度为8μg/ 106 磁珠，将有偶联后的磁珠稀释至50 个/μL，取50μL 稀释后的磁珠加入96 孔板。以禽流感阳性血清为阳性对照，以SPF 级鸡阴性血清作为阴性对照，分别1 ∶100 倍稀释，每孔加入50μL 稀释后血清，混匀后室温震摇2 小时。洗液洗2 遍后，按100μL/孔加入2mg/L 的生物素标记二抗，室温振摇30 分钟。洗液洗2 遍后，按100μL/孔加入2mg/L 的SAPE，室温振摇30分钟。洗液洗2 遍后加入100μL/孔洗液，在液相芯片检测系统Luminex 2000 上读取MFI 值，并计算阳性血清荧光信号值（MFI）值与阴性MFI 值的比值，即P/N 值。若P/N 值＞5，表明包被的蛋白抗原性较好，值得进一步优化反应条件。

1.4 xMAP 检测条件的优化将NP 蛋白按1、2、4、8、16和32μg/106磁珠的浓度分别包被磁珠。将AIV 阳性血清和SPF 鸡血清分别稀释25 倍，随后作2 倍倍比稀释，按照1.3的方法检测。上机读取MFI 值，计算对应稀释倍数阳性血清与阴性血清的MFI 比值（P/N 值）；以检测灵敏度最高且P/N 最大的蛋白包被浓度为抗原最佳工作浓度。

1.5 特异性试验将AIV、IBV、ILTV、AIV、NDV、MDV、IBDV 和ALV 阳性血清进行1 ∶100 稀释，按优化后的NP 蛋白包被浓度检测上述血清，并使用SPF 鸡血清作阴性对照血清，验证特异性，方法同1.3。

1.6 灵敏性试验将AIV 阳性血清稀释25 倍，随后作2 倍倍比稀释，按优化后的NP 蛋白包被浓度检测上述血清，SPF鸡血清作为阴性对照，PBS 作为空白对照，检验灵敏性。

同时使用商品化ELISA 试剂盒同步检测，具体操作按照试剂盒说明书进行：通过对比两种方法检出阳性的血清最低稀释倍数来比较两种检测方法的灵敏度。

1.7 重复性试验用所建立的方法对1∶200 稀释阳性血清进行重复性检测，同一批内每个检测样品进行3 次重复测定，对MFI 值进行统计，计算批内变异系数（CV）。对上述样品进行3次测定，计算同一样品测定结果之间的批间变异系数（CV）。

1.8 临床样本的检测利用所建立的xMAP 方法和商品化ELISA 试剂盒对收集到的28 份临床样本进行检测，对比两者的阳性检出率及符合率。

2 结果

2.1 AIV xMAP检测方法建立将重组蛋白包被荧光磁珠后，用AIV阳性对照血清，阴性血清对照作为检测样品，进行间接免疫试验，经Luminex 200仪器检测，结果如图1 所示，阳性血清的MFI 值高达7789.5，阴性血清仅66.5-76，二者差异明显，说明包被的AIV NP 重组蛋白能够很好地识别AIV 阳性血清，抗原性较好。

图1 NP 蛋白xMAP 检测AIV 阳性血清和阴性血清

2.2 AIV 重组抗原最佳包被浓度确定每1×106个磁珠分别包被1μg，2μg，4μg，8μg，16μg，32μg 共6 个浓度，按照1.3 的检测方法进行检测，结果表明16μg/1×106个磁珠的包被浓度时P/N 平均值最高，达198.08，最终确定使用16μg/1×106个磁珠的包被浓度（表1 和表2）。

表1 不同浓度NP 蛋白包被MFI 值

表2 不同浓度NP 蛋白包被的P/N 值

2.3 特异性的检测采用建立的xMAP 方法对NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV、MDV 和ALV 阳性血清进行检测，验证该方法的特异性。结果除AIV 为阳性外，其他病毒血清均为阴性（P/N 值小于2.5），不存在交叉反应，表明建立的方法具有良好的特异性（表3 和图2）。

表3 xMAP 检测AIV 的特异性检测

图2 特异性实验的结果

2.4 xMAP 与ELISA 的灵敏度比较

xMAP 与ELISA 分别检测稀释度1∶25～1∶409600的AIV 阳性血清。结果显示，xMAP 能检测到的AIV阳性血清的最高稀释度为1∶ 102400；而ELISA 能检测到的最高稀释倍数为1∶100（表4 和图3）。

图3 xMAP 与ELISA 方法检测AIV 的灵敏度

表4 xMAP 与ELISA 方法检测AIV 的灵敏度

2.5 重复性实验结果使用所建立的方法对1 ∶200 倍数稀释的阳性血清和阴性对照血清进行重复检测，同一次实验对阳性样品作3 次重复测定，读取MFI 值并计算其P/N 值，统计P/N 值并计算批内变异系数（CV 值）；重复上述实验3次，对比不同次实验里的批内变异系数，对不同次实验的平均P/N 值统计并计算其批间变异系数。

三次重复实验的批内变异系数分别为1.97%，3.36%，1.18%，其中最大值为3.36%；批间变异系数为7.66%。以上结果均小于10%，表明该检测方法具有较好的重复性（表5）。

表5 重复性实验结果

2.6 临床样品检测应用建立的AIV xMAP 方法与ELISA 方法比较，对28 份临床样样本进行检测，检测结果见表6。AIV 检测中，xMAP 检测出28 例阳性，0 例阴性；ELISA 检测出28 例阳性，0 例阴性。两种检测方法结果相符（表7）。

表6 xMAP 与ELISA 检测临床样本结果比较

注：下划线为阳性

表7 xMAP 与ELISA 的符合率

3 结论

本研究初步建立了AIV 抗体的xMAP 检测方法；确定了AIV NP 蛋白的最佳抗原包被浓度为16μg/106个磁珠。特异性实验结果显示所建立的方法与ILTV、IBV、NDV、MDV、IBDV、ALV 阳性血清没有交叉反应，表明该方法特异性良好。对AIV 阳性血清检测的灵敏度高于ELISA 方法1024 倍。重复试验中，批内CV 值最高为3.36%，批间CV 值为7.66%，表明重复性较佳。对28 份临床样品检测与ELISA 结果相符。综上，本研究建立了一种特异性、灵敏性和重复性均良好的xMAP 检测方法。但xMAP 检测的优势在于多重检测，本研究仅建立了AIV 抗体检测方法，尚不能发挥多重检测的优势，有待于进一步建立ILTV、IBV、NDV 等病原抗体的xMAP 方法，然后联合使用。本研究采集临床样品的鸡场均免疫了禽流感疫苗，检测结果100%阳性率，表明免疫程序规范均产生抗体。推测因免疫后抗体水平较高，因此即使检测灵敏度较低的ELISA 方法仍100%检出。