范 蓉，郭亚萍，赵柯柯，姜梦辉，石颖颖，曲延英，陈全家

(新疆农业大学 农学院 棉花教育部工程研究中心, 乌鲁木齐 830052)

棉花是世界上最重要的经济作物和纤维作物之一，苗期干旱和盐碱是影响棉花生长和导致减产的重要因素[1]。当植物受到干旱、盐胁迫时，植物会通过信号传递激发转录因子，转录因子与启动子区的顺式作用元件相结合启动特定基因的表达，从而对胁迫应答[2]。明确棉花抗旱、耐盐相关转录因子的表达模式，可为棉花抗逆性鉴定分子指标体系的建立提供依据与参考。

转录因子HSFA、bZIP和NAC在作物对抗干旱盐碱等逆境过程中扮演着重要的角色。研究表明，HSFA类转录因子参与植物干旱、高盐等多种逆境胁迫[3]。在棉花[4]、拟南芥[5-6]中，HSFA类转录因子受到干旱处理的上调诱导，过表达的HSFA在拟南芥中起正调控作用，并且拟南芥在缺水和限水条件下收获指数和产量有一定提高。过表达GhHsfA7的棉花[4]植株SOD、 APX、 CAT 等 ROS 清除酶的活性升高，同时提高了棉花的耐盐性。干旱胁迫下bZIP在水稻[7]、大豆[8]、玉米[9]、番茄[10]中的表达均显著上调，并且在转基因植株中显著增强了作物的抗性。李月等[11]对转录因子基因GhbZIP15克隆与表达分析中发现GhbZIP15参与棉花的非生物胁迫应答。Mittal等[12]发现将拟南芥AtAB15转化棉花可以增强转基因棉花的抗旱性。关于NAC类转录因子，研究表明在拟南芥[13]、水稻[14]、玉米[15]、马铃薯[16]、高粱[17]、鹰嘴豆[18]等植物中，NAC转录因子响应非生物胁迫，过表达的NAC2提高了转基因马铃薯在逆境条件下的耐受性。

目前，众多学者对棉花的抗旱性及耐盐性鉴定一般从生理指标变化及植株形态等方面入手，其中，常用的抗旱性和耐盐性鉴定的生理指标有MDA、Pro、SOD、POD及EL等[19-20]。当植物受到干旱或高盐胁迫时，原生质膜损伤，植物受到活性氧的破坏，MDA含量积累增加，质膜透性增加，而细胞内含物质被动外渗，EL升高[21]。为应对干旱或高盐造成的伤害，植物常通过增加或减少Pro等渗透调节物质，从而降低细胞水势，改变体内SOD、POD等酶活力来适应水分的变化，通过清除氧自由基，来减轻胁迫对植物的伤害[22-23]。

转录因子响应胁迫过程较复杂，胁迫时间的长短对基因的表达量具有显著影响[24]。因此，筛选出响应逆境胁迫相关的基因及其最适胁迫时间尤为重要。本试验研究PEG、NaCl胁迫下棉花5个常用抗旱耐盐生理指标及关键基因GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2表达情况，并进一步分析抗旱耐盐生理指标与这些基因的相关性，以期筛选出抗旱及耐盐基因作为棉花抗旱性及耐盐性鉴定的分子指标的参考，为棉花抗逆机制的研究提供依据与参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选用2个抗旱耐盐品种‘KK1543’‘CQJ-5’和2个敏旱敏盐品种‘新陆早26’‘石远321’为试验材料，由新疆农业大学农生重点实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 材料培养方法

选取籽粒饱满、大小一致的棉花种子用70%的酒精消毒5 min，再经15%的H2O2表面灭菌4 h，用无菌水冲洗4～5次放入三角瓶中，浸种至种子露白，转至放有两层滤纸的发芽盒中，保持湿润。待长出两片子叶后，选取长势强壮、均一的棉花幼苗转入1/2 Hoagload营养液中，温室水培。16 h光照/8 h黑暗，25 ℃，3 d更换1次营养液。

棉花长3至4片真叶时，处理组胁迫浓度参照前人研究结果[25-26]，PEG模拟干旱胁迫组用含有15% PEG6000的营养液胁迫处理3、6、12和24 h；盐胁迫组用含有250 mmol/L NaCl的营养液胁迫处理3、6、12和24 h。对照组用1/2 Hoagload营养液继续培养，每个处理3个重复，每个重复为3株样品。胁迫结束后，立即采棉花第二片真叶，放入液氮中速冻后用于提RNA，并立即检测处理组与对照组生理指标MDA、Pro、SOD、POD及EL。

1.2.2 实时荧光定量PCR

提取叶片总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA第一链。选取与植物抗旱、耐盐相关转录因子GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2为目标基因，GhUBQ7为内参基因，根据NCBI上公布的基因序列，运用软件Primer premier 5.0[11]，分别设计特异性引物，引物送华大基因科技有限公司合成。

qRT-PCR反应程序采用两步法：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。反应结束后将数据导出到Microsoft Excel进行统计和计算分析。相对表达量的计算方法参照秦鹏等[24]使用的2-ΔΔCt方法。

由图3可知，不同适应活化条件对酵母菌产气能力有较大影响，随活化基质中碳源和氮源含量的增加，酵母菌的产气量基本呈上升趋势。尽管有氧呼吸时CO2的产量远高于厌氧条件下，但厌氧条件活化所得酵母菌在随后的发酵试验中展现了远高于有氧条件活化菌株的产气能力，这可能是由于厌氧条件下，某些参与TCA循环的酶仍然保持活性，这些额外的代谢途径能够合成细胞功能所需的重要前体物质，并决定最终产气体积[22]。

表1 研究中使用的基因与引物信息

1.2.3 生理指标测定

丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[27]；脯氨酸(Pro)含量测定采用水合茚三酮法测定[27]；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用NBT光化学还原法测定[27]；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法[27]；电解质外渗法检测电渗率(EL)[28]。

1.3 数据分析

运用Excel 2007进行数据整理计算，DPS进行方差分析[11]，Graph Pad Prism 5绘柱状图及箱图，相关性是通过软件SPSS 20的双尾t检验进行分析[24]。

2 结果与分析

2.1 PEG模拟干旱胁迫下棉花转录因子表达量分析

2.1.1 PEG胁迫下棉花GhHsfA7的表达分析

PEG胁迫下，不同棉花品种中GhHsfA7的表达模式如图1(a)，在抗旱品种(CQJ-5和KK1543)中，GhHsfA7相对表达量呈现先上调后下调的趋势。在PEG胁迫的3、6 h，两个抗旱品种的GhHsfA7相对表达量都较高且差异不显著，均在6 h表达量达到极值，分别是对照的3.06和3.56倍；在敏旱品种(新陆早26和石远321)中GhHsfA7的相对表达量都呈现先下调后上调再下调的趋势，在6 h表达量达到极值，分别是对照的1.08和1.23倍。

在PEG胁迫下，GhHsfA7在不同棉花品种表达变化如图1(b)，抗旱品种中GhHsfA7在3、6和12 h的相对表达量极显著高于敏旱品种，表明GhHsfA7在干旱胁迫中发挥了正调控的作用。在抗旱和敏旱品种中GhHsfA7的相对表达量均在胁迫6 h达到最大值，该时间GhHsfA7的相对表达量可作为鉴定棉花抗旱性的一个重要指标。

不同小写字母表示在0.05水平存在显著差异；**表示在0.01水平存在显著差异。图1 PEG胁迫下GhHsfA7在棉花中的表达变化Figure 1 Changes of GhHsfA7 expression in cotton under PEG stress

2.1.2 PEG胁迫下棉花GhbZIP15的表达分析

不同小写字母表示在0.05水平存在显著差异。**表示在0.01水平存在显著差异；*表示在0.05水平存在显著差异。图2 PEG胁迫下GhbZIP15在棉花中的表达变化Figure 2 Changes of GhbZIP15 expression in cotton under PEG stress

在PEG胁迫下，GhbZIP15在不同棉花品种表达变化如图2(b)，抗旱品种中GhbZIP15在各时间段的相对表达量显著或极显著高于敏旱品种，表明GhbZIP15在干旱胁迫中发挥了正调控的作用。在抗旱和敏旱品种中GhbZIP15的相对表达量在胁迫6 h达到最大值，该时间GhbZIP15的相对表达量可作为鉴定棉花抗旱性的一个重要指标。

2.1.3 PEG胁迫下棉花GhNAC2的表达分析

PEG胁迫下，不同棉花品种中GhNAC2的表达模式如图3(a)，GhNAC2相对表达量呈现先上调后下调的趋势。在CQJ-5 中，GhNAC2在6 h下达到极值，表达量是对照的7.64倍；在KK1543中，GhNAC2在6、12 h下表达量较高，在12 h下达到极值，表达量是对照的3.99倍；在敏旱品种(新陆早26，石远321)中，GhNAC2在6 h下达到极值。在新陆早26中，GhNAC2在6 h表达量是对照的2.48倍；在KK1543中，GhNAC2在6 h表达量是对照的3.93倍。

在PEG胁迫下，GhNAC2在不同棉花品种表达变化如图3(b)，在抗旱品种中GhNAC2在3、6和12 h下的相对表达量显著或极显著高于敏旱品种，表明GhNAC2在干旱胁迫中发挥了正调控的作用。在抗旱和敏旱品种比较中GhNAC2的相对表达量在胁迫6 h下达到最大值，该时间GhNAC2的相对表达量可作为鉴定棉花抗旱性的参考指标。

不同小写字母表示在0.05水平存在显著差异。**表示在0.01水平存在显著差异；*表示在0.05水平存在显著差异。图3 PEG胁迫下GhNAC2在不同棉花品种中的表达变化Figure 3 Expression changes of GhNAC2 in different cotton varieties under PEG stress

在PEG胁迫下，不同品种棉花中GhHsfA7、GhbZIP15、GhNAC2均在6 h下高表达，表达总量依次为GhNAC2(18.04)>GhbZIP15(9.99)>GhHsfA7(8.93)，抗旱品种(CQJ-5和KK1543) 与敏旱品种(新陆早26，石远321基因表达量间存在显著或极显著差异。

2.2 NaCl胁迫下转录因子表达量分析

2.2.1 NaCl胁迫下棉花GhHsfA7的表达分析

NaCl胁迫下，不同棉花品种中GhHsfA7的表达模式如图4(a)，在耐盐品种(CQJ-5和KK1543)中表达呈现先上调后下调再上调再下调的趋势，GhHsfA7在3、12 h下表达量达到峰值，在3 h下达到极值，分别是对照的3.86、4.61倍；GhHsfA7在敏盐品种(新陆早26和石远321)中表达呈现先上调后下调的趋势，在 3 h下表达量达到极值，分别是对照的2.98、2.28倍。

在NaCl胁迫下，GhHsfA7在不同棉花品种表达变化如图4(b)，耐盐品种中GhHsfA7在3、6、12和24 h下的相对表达量极显著高于敏旱品种，表明GhHsfA7在盐胁迫中发挥了正调控的作用。在耐盐与敏盐品种中GhHsfA7的相对表达量均在胁迫3 h下达到最大值，该时间GhHsfA7的相对表达量可作为鉴定棉花耐盐性的一个重要指标。

2.2.2 NaCl胁迫下棉花GhbZIP15的表达分析

NaCl胁迫下，不同棉花品种中GhbZIP15的表达模式如图5(a)。GhbZIP15相对表达量呈现先上调后下调的趋势。在CQJ-5 中GhbZIP15表达量在6 h达到极值，是对照的2.91倍；在KK1543中GhbZIP15表达量在3 h达到极值，是对照的2.49倍；在敏旱品种(新陆早26和石远321)中GhbZIP15表达量在3 h达到极值，分别是对照的1.58和1.49倍。

不同小写字母表示在0.05水平存在显著差异。**表示在0.01水平存在显著差异；*表示在0.05水平存在显著差异。图4 NaCl胁迫下GhHsfA7在棉花中的表达变化Figure 4 Changes of GhHsfA7 expression in cotton under NaCl stress

在NaCl胁迫下，GhbZIP15在不同棉花品种表达变化如图5(b)，耐盐品种中GhbZIP15在3、6、12和24 h下的相对表达量极显著高于敏旱品种，表明GhbZIP15在盐胁迫中发挥了正调控的作用，在胁迫3 h下达到最大值。

不同小写字母表示在0.05水平存在显著差异。**表示在0.01水平存在显著差异；*表示在0.05水平存在显著差异。图5 NaCl胁迫下GhbZIP15在棉花中的表达变化Figure 5 Changes of GhbZIP15 expression in cotton under NaCl stress

2.2.3 NaCl胁迫下棉花GhNAC2的表达分析

NaCl胁迫下，不同棉花品种中GhNAC2的表达模式如图6(a)，GhNAC2相对表达量呈现先上调后下调的趋势。在耐盐品种(CQJ-5和KK1543)中GhNAC2表达量在3 h下达到极值，是对照的3.35和3.84倍；在敏盐品种新陆早26中GhNAC2表达量在3 h下达到极值，是对照的1.99倍。在KK1543中GhNAC2表达量在6 h下达到极值，是对照的1.33倍。

在NaCl胁迫下，GhNAC2在不同棉花品种表达变化如图6(b)，耐盐品种中GhNAC2在3、6和12 h下的相对表达量极显著高于敏旱品种，表明GhNAC2在盐胁迫中发挥了正调控的作用。在耐盐与敏盐品种中GhNAC2的相对表达量均在胁迫3 h下达到峰值，该时间GhNAC2的相对表达量可作为鉴定棉花耐盐性的一个重要指标。

在NaCl胁迫下，不同品种棉花中GhHsfA7、GhbZIP15、GhNAC2在3 h下高表达，表达总量依次为：GhHsfA7(13.73)>GhNAC2(10.51)>GhbZIP15(8.20)，抗旱品种(CQJ-5和KK1543) 与敏旱品种(新陆早26和石远321)基因表达量间存在显著或极显著差异。

2.3 干旱胁迫和盐胁迫下棉花生理指标差异分析

测定PEG模拟干旱胁迫6 h、NaCl胁迫3 h及对照棉花不同品种5项生理指标变化如表2所示。模拟干旱胁迫与高盐胁迫后棉花5项生理指标与对照之间存在显著差异。并且抗逆性不同的棉花品种中生理指标间也存在显著差异。耐受型棉花品种(CQJ-5和KK1543)Pro、SOD及POD相对变化均大于敏感型品种(新陆早26和石远321)，而MDA和EL相对变化均小于敏感型品种。

不同小写字母表示在0.05水平存在显著差异。**表示在0.01水平存在显著差异；*表示在0.05水平存在显著差异。图6 NaCl胁迫下GhNAC2在棉花中的表达变化Figure 6 Changes of GhNAC2 expression in cotton under NaCl stress

表2 干旱胁迫和盐胁迫下棉花生理指标变化

2.4 3个转录因子基因表达量与生理指标相关性分析

3个转录因子的相对表达量与5个生理指标相对变化相关性如表3所示。相关性是通过SPSS 20软件的双尾t检验进行分析得到pearson相关系数，表现基因与生理指标间的密切程度和变化趋势。PEG胁迫下，GhHsfA7与Pro存在极显著正相关，GhbZIP15与MDA、 EL存在显著或极显著负相关，GhNAC2与SOD、POD存在显著正相关。NaCl胁迫下，GhHsfA7与Pro存在显著正相关,与EL间存在显著负相关，GhbZIP15与Pro存在显著正相关，GhNAC2与SOD、POD存在显著正相关，与MDA、EL存在显著负相关。

表3 3个转录因子基因表达量与生理指标相关性分析

3 讨论与结论

本研究中，不同品种棉花受到干旱和盐胁迫时，转录因子GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2均起正调控的作用，这与以前报道的研究结果一致[4,11,18]。在PEG胁迫6 h和NaCl胁迫3 h下，GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2的综合表达量达最大值。虽然3个转录因子的表达趋势不一致，但不同品种间存在一定关联，耐受型品种中的表达均显著高于敏感型品种；PEG胁迫下，3个转录因子均在敏感品种‘新陆早26’表达量最低；NaCl胁迫下，3个转录因子均在敏感品种‘石远321’表达量最低。说明在不同的棉花品种中，调控GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2转录因子表达的途径存在差异，可能是这些转录因子的启动子序列含有不同的顺式作用元件，也可能是这些转录因子上游的基因存在差异[24]。

本研究通过相关性分析发现，GhHsfA7在PEG和NaCl胁迫下与Pro存在极显著正相关，与EL存在显著负相关，说明GhHsfA7可能参与调控渗透调节物质的积累从而提高植物的保水性，使得细胞膜受伤害程度小，电解质外渗少，以此应对盐胁迫对植物的伤害。GhbZIP15在PEG胁迫下与MDA、 EL存在显著或极显著负相关，说明GhbZIP15可能与合成膜脂过氧化产物起负调控作用，同时植物细胞膜完整性较好，棉花受伤害程度小。GhNAC2与SOD、POD间存在显著正相关，说明GhNAC2可能参与调控活性氧清除相关的酶表达，从而提提高酶活力，清除植物体内自由基，对细胞膜产生保护作用，降低胁迫对植物的伤害。研究表明，在玉米[29]、大麦[30]、棉花[31]、油菜[32]等作物中，敏旱品种MDA 的积累量与电解质渗透率较高，抗旱品种游离脯氨酸积累量、SOD与POD酶活性较高，以上研究结果与本研究结果一致。

PEG胁迫6 h与NaCl胁迫3 h下，GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2的表达量可作为棉花抗旱、耐盐性鉴定的分子指标的参考。不同棉花品种在逆境胁迫下有多个信号途径协同作用，并且发挥作用，响应时间也不尽相同。因此，想要准确、快速地鉴定棉花品种的抗旱耐盐性，还需要不断丰富棉花抗旱耐盐性鉴定的分子指标，为抗旱耐盐性鉴定体系的建立提供依据。