关正君，霍艳林

(1. 运城学院 生命科学系，运城 044000； 2. 运城学院 理科实验中心，运城 044000)

随着抗虫转Bt基因植物的商业化生产和大面积种植，Bt毒蛋白在转基因植物中的表达问题日益引起人们的重视。转Bt基因棉花体内的外源基因及其表达产物会通过根系分泌物或植株残体等方式进入自然界土壤环境中[1-2]。转Bt基因作物表达的Bt蛋白进入自然界土壤环境后能够存留并保持一定的杀虫活性，可直接作用于土壤生物体，最终可能会影响整个土壤生态系统的安全，其潜在的危害性可能比土壤中残留的商业Bt制剂前毒素危害性更大[3]。研究表明，由苏云金芽孢杆菌产生的Bt杀虫晶体蛋白进入泥土后，可与腐殖酸、黏土矿物和有机矿物聚合体等泥土的表面活性颗粒快速、紧密的结合，结合态的Bt毒素保持较高的杀虫性，并且更不容易被微生物降解[4-5]。因此，研究和监测转Bt基因棉花植株体内表达的Bt蛋白在自然界农田生态系统土壤环境中的残留情况，对保护生态环境安全以及维持生物多样性具有非常重要的意义[6-8]。

目前对转Bt基因棉花释放后对土壤生态系统影响的研究报道相对较少，有的研究由于研究周期短、研究内容不全面，因此很难揭示转Bt基因棉花对农田土壤生态系统的真正影响[9]。国内外已报道的大多数研究都是通过室内模拟试验得出结论，而对Bt蛋白在自然界土壤环境中的存留、降解动态规律的研究工作比较缺乏[10]。本研究以晋南长期种植转Bt基因棉花的自然棉田为研究对象，探究转Bt基因棉花在收获时期不同区域植株根、叶Bt蛋白的含量变化与棉田根际土壤Bt蛋白残留情况，以期为转Bt基因作物生态安全方面提供理论基础，也为转Bt基因棉花合理的商业化种植提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品的采集

以晋南地区连续多年长期种植(>5 年)转Bt基因棉花且种植面积较大的县(市)自然棉田作为采集样地，每个县(市)选取3个样地，每个样地重复3次，在棉花收获后期进行样品采集。选取运城市盐湖区龙居镇(简称龙居)、运城市盐湖区金井乡(简称金井)、永济市开张镇(简称永济)、临汾市尧都区县底镇(简称县底)和临汾市大宁县(简称大宁)这5个区域(表1)，采集转Bt基因棉花大田中根际土壤与非根际土壤样品、叶片和根部样品。

表1 转Bt基因棉田采集样地信息

1.2 Bt蛋白的提取

采用美国Envirologix公司的Bt Cry1Ab/Cry1Ac酶联免疫吸附试剂盒(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)进行Bt蛋白的提取[11]。分别称取0.5 g土样、0.1 g根和0.01 g叶片，将样品分别放入离心管中。将根和叶加入适量提取液用液氮研磨，土样中加入适量提取液，混匀，静置30 min左右。将各样品在6 000 r/min下离心5 min，提取上清液备用。由于有的样品浓度太高，无法从酶标仪上读取准确数值，须将预实验中获得高Bt含量的样品上清液稀释10倍待用。

1.3 Bt蛋白含量的测定

采用美国Envirologix公司的Bt Cry1Ab/Cry1Ac酶联免疫吸附试剂盒进行Bt蛋白含量的测定。在每个酶标板样孔中，加入50 μL Cry1Ab/Cry1Ac Enzyme Conjugate。迅速加入50 μL 各样品提取液，快速混合均匀。用封口膜盖上孔板以防止挥发，室温放置1～2 h。小心移除封口膜，将其孔内的溶液倒出，用清洗液冲洗3次，甩干孔内的清洗液。加入100 μL Substrate 到每孔中，混匀，封上新的封口膜，放置15～30 min。加入100 μL Stop Solution 到每孔中，混匀，颜色会变黄。30 min 内用酶标仪读取OD450下吸光度值。绘制标准曲线，根据标准曲线计算出Bt 蛋白含量。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2010 软件与SPASS 18.0进行数据的统计、分析与作图，并运用Duncan’s 法进行差异显著性检验分析。

2 结果与分析

2.1 Bt蛋白在转Bt基因棉花农田土壤中的残留情况

本研究对晋南地区5个县(市)转Bt基因棉花收获后期土壤Bt蛋白的残留情况进行了调查和测定。结果(表2)显示：运城市盐湖区龙居镇的转基因棉田根际土壤中Bt蛋白残留量最高，达0.167 2 ng/g(P<0.05)；临汾市大宁县次之，其根际土壤Bt蛋白残留量为0.154 1 ng/g；永济市开张镇的转基因棉田根际土壤中Bt蛋白残留量最低，为0.116 6 ng/g(P<0.05)。与根际土壤相比，5个县(市)转Bt基因棉田的非根际土壤中Bt蛋白残留量为0.055 8～0.063 3 ng/g，且各供试县市间棉田非根际土壤的Bt蛋白残留量差异不显著。

在转Bt基因棉花的收获后期，同一个县(市)的不同样地间棉田土壤中的Bt蛋白残留量有所不同(表2)。各县市不同样地棉田根际土壤Bt蛋白残留量变化范围为0.112 0～0.184 8 ng/g。永济市开张镇和运城市盐湖区金井乡的不同样地间根际土壤Bt蛋白残留量均无显著差异。运城市盐湖区龙居镇样地I和II的根际土壤Bt蛋白残留量显著高于样地III(P<0.05)；临汾市大宁县样地I的根际土壤Bt蛋白残留量显著高于样地II和III，为0.164 7 ng/g(P<0.05)；临汾市尧都区县底镇样地II的根际土壤Bt蛋白残留量最高(P<0.05)，达0.161 4 ng/g。各县市不同样地棉田非根际土壤Bt蛋白残留量变化范围为0.049 2～0.088 3 ng/g。永济市开张镇、运城市盐湖区龙居镇和临汾市尧都区县底镇这3个县(市)的不同棉田样地间非根际土壤Bt蛋白残留量存在显著差异(P<0.05)；永济市开张镇样地II的非根际土壤中Bt蛋白残留量最高(0.075 5 ng/g，P<0.05)；临汾市尧都区县底镇样地I的非根际土壤中Bt蛋白残留量最低(0.049 2 ng/g，P<0.05)。

表2 不同区域转Bt基因棉田土壤Bt蛋白含量

2.2 农田中转Bt基因棉花根和叶中Bt蛋白含量变化

在收获后期，晋南地区5个供试县(市)的转Bt基因棉花根和叶片的Bt蛋白含量的测定结果(表3)表明：在转Bt基因棉花的收获后期，临汾市尧都区县底镇的转基因棉花根中Bt蛋白含量最高(P<0.05)，达18.09 ng/g；其他4个县市次之，且龙居镇转基因棉花根的Bt蛋白含量最低，为13.19 ng/g (P<0.05)。供试5个县(市)间转基因棉花叶片Bt蛋白含量均存在显著差异。永济市开张镇的转基因棉花叶片Bt蛋白含量最高(120.83 ng/g，P<0.05)；临汾市尧都区县底镇次之(111.35 ng/g)；临汾市大宁县转基因棉花叶片的Bt蛋白含量最低(87.63 ng/g，P<0.05)。

表3 不同区域转Bt基因棉花根和叶片Bt蛋白含量

供试5个县(市)的不同样地间，转Bt基因棉花根的Bt蛋白含量较为相近，变化范围为12.57～19.34 ng/g(表3)。永济市开张镇、运城市盐湖区金井乡和龙居镇以及临汾市大宁县4个县(市)各样地间，转Bt基因棉花根的Bt蛋白含量无明显差异；临汾市尧都区县底镇样地III转Bt基因棉花根Bt蛋白含量最高，为19.34 ng/g，且显著高于样地I(P<0.05)。5个县(市)不同样地间转Bt基因棉花叶片的Bt蛋白含量变化范围为83.19～128.11 ng/g，均具有显著差异。运城市盐湖区金井乡的样地III棉叶Bt蛋白含量显著高于其他两个样地(P<0.05)。运城市盐湖区龙居镇与临汾市大宁县的样地I显著高于同一县(市)的其他两个样地(P<0.05)。

2.3 Bt蛋白在农田生态系统中的残留情况

为了探究大田条件下转Bt基因作物表达的Bt蛋白在农田生态系统中的残留情况，本研究综合分析了在转Bt基因棉花收获时期，晋南地区生态系统环境中Bt蛋白在棉田土壤中的残留情况、转基因植株根、叶等营养器官中Bt蛋白的表达情况(图1)。在晋南地区连续多年种植转Bt基因棉花的农田生态系统中，Bt蛋白在土壤环境中的残留量非常低，仅为0.146 9 ng/g±0.018 6 ng/g。在转Bt基因棉花收获期，其根、叶等营养器官中的Bt蛋白含量差异较大，根中Bt蛋白平均含量为14.96 ng/g±1.65 ng/g，叶片中Bt蛋白平均含量为104.21 ng/g±2.22 ng/g，约为根Bt蛋白含量的10倍。

图1 转基因棉田Bt蛋白总体残留情况Figure 1 General situation of Bt protein residue in transgenic cotton field

3 讨论与结论

本试验对晋南地区5个区域连续种植的不同转基因棉花土壤中Bt蛋白残留情况进行检测，结果发现，各采集样地的转基因棉田土壤中均有Bt蛋白的残留，且存在一定的差异。同一样地根际土和非根际土Bt蛋白含量也存在着差异。所有根际土检测样品的Bt蛋白含量为0.112 0～0.184 8 ng/g。这一研究结果与已有的研究报道结果相似，Bt蛋白在土壤环境中的残留水平非常低[2,12-13]。由此推测，连续种植转基因棉花的棉田土壤中Bt蛋白的残留可能对农田生态系统不会产生明显的影响。本研究采用的ELISA检测方法可检测出Bt蛋白的下限为0.1 ng/g，低于该检测值，则可认为土壤中不存在Bt蛋白。在检测过程中，各样地非根际土的含量均小于0.1 ng/g。因此表明，连续种植转基因棉花的棉田非根际土壤中不存在Bt蛋白，与陈彦君等[6]和李自张[2]研究结果一致。Bt蛋白进入土壤中不仅以简单的游离方式存在，还会更多吸附土壤表面活性颗粒而残留在土壤中[14]。本试验结果中不同样地含有不同的Bt蛋白含量，可能由于不同采集样地具有不同的土壤类型、土壤温度以及土壤中微生物种类不同等原因所致[10]。

随着秸秆还田技术的发展，作物植株的叶和根是Bt蛋白进入土壤中的重要途径，探明转基因棉花叶、根中的Bt蛋白含量尤为重要，有助于为研究转Bt基因棉花的不同营养器官对土壤Bt蛋白残留的影响提供参考。本研究结果表明，各采集样地转Bt基因棉花根和叶中均可检测到不同含量的Bt蛋白，且具有显著差异。原因可能由于不同地区气候条件不同，导致不同棉花品种生长的生态环境与生长情况各有差异[15-18]。在本试验中，检测到大田连续种植的转Bt基因棉花，根中Bt蛋白含量为12.57～19.34 ng/g；叶中Bt蛋白为83.19～128.11 ng/g。表明转基因棉花在收获期，其叶和根中Bt蛋白含量明显不同，从Bt蛋白进入土壤的途径来看，通过棉叶残体进入土壤中的Bt蛋白含量可能要高于通过根系进入土壤中的量。因此，在棉花秸秆还田过程中可能会有大量Bt蛋白进入土壤中，对农田生态系统产生一定的影响[19-20]。有必要深入系统地研究和评价转Bt基因棉花大田连续种植过程中Bt蛋白对棉田环境和周边生态系统的影响，同时需要对外源蛋白在土壤中的残留情况进行长期连续监测[21]。

本研究对晋南地区的5个县(市)连续种植的转Bt基因棉花根际土壤的Bt蛋白残留情况和根叶蛋白质含量进行检测。结果表明，各采集样地根际土壤均有Bt蛋白残留，且存在差异，Bt蛋白含量最高为0.184 8 ng/g，最低为0.112 0 ng/g。表明连续种植转基因棉花的土壤中可能只有低剂量的Bt蛋白残留。转Bt基因棉花的根和叶中均可检测到Bt蛋白，且根和叶之间的Bt蛋白含量不同，有明显差异。根中Bt蛋白含量为12.57～19.34 ng/g；叶中Bt蛋白含量为83.19～128.11 ng/g。表明在收获期转基因棉花叶中Bt蛋白含量较高，由此推测通过棉叶还田进入土壤生态系统中的Bt蛋白可能会造成Bt蛋白在土壤中累积。