赵春芳， 连 玲， 杨 宁， 任 曼， 靳二辉，胡倩倩， 郑美丽， 李升和*

(1.安徽科技学院 动物科学学院 安徽省动物营养调控与健康重点实验室，安徽 凤阳 233100；2.中国农业大学 动物科技学院，北京 100193；3.北京市畜牧总站，北京 100107)

马立克氏病(Marek's Disease, MD)是一种由马立克氏病病毒(Marek's disease virus, MDV)引起的细胞接触性、高度原癌性和淋巴增生性的禽类疾病，患病家禽通常表现出免疫抑制、神经炎和T细胞淋巴瘤形成的症状。雏鸡感染MDV后会导致血细胞发育成熟受阻。日粮中添加聚苹果酸钙和大蒜素可以促进肉鸡免疫器官的生长发育，或许可提高鸡群对MDV等病菌感染的抵抗力。体内的干扰素IFNα和IFNγ能够延缓MD的发生和蔓延，阻断内源性IFNα能够加速MD的病程。在MDV中已发现一些病毒基因与其致病性密切相关，其中

Meq

基因决定MDV的原癌性。MDV可以感染自然杀伤细胞，而Meq基因的存在有助于自然杀伤细胞的激活。Meq基因可以与转录共遏因子C-末端结合蛋白CtBP发生功能性结合，从而调节细胞发育、增殖和凋亡过程。如果CtBP结合域发生突变能够完全破环MDV的致癌性，说明Meq与CtBP的结合域对于维持病毒的原癌性至关重要。尽管MD可以用疫苗预防，但是随着病毒毒力的增强，我们需要从不同的视角研究MD的致病机理，从而为该病的防治提供更多的思路。

目前已有一些研究利用MD模型分析宿主和病毒miRNA的表达变化。Tian等利用miRNA芯片筛选对MDV感染较敏感的miRNA，结果在72易感系中发现有64个候选miRNAs感染MDV后出现表达差异。Teng等发现原癌病毒GaHV2中的miR-M31-3p和miR-M11-5p在MD肿瘤发生中分别扮演潜在原癌基因和肿瘤抑制因子的角色。Zhang等发现MDV编码的miR-M4虽然在MDV引发的淋巴瘤和淋巴细胞系中高表达，但是对于维持肿瘤细胞的转化状态并不是必需的。

先前利用Solexa深度测序分析了MD致瘤组和MDV未感染组的miRNA表达谱，发现gga-miR-29b-3p在MDV引发的肿瘤组织中表达异常。本研究分析该miRNA潜在靶基因的功能，检测其对MD肿瘤细胞MSB1中与侵袭密切相关的

MMP2

、

MMP9

基因，以及MDV原癌基因

Meq

表达的影响。

1 材料与方法

1.1 样品收集

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供试验鸡群和马立克氏病病毒毒株(MDV-GA)。选择1日龄无特定病原体(Specific pathogen free, SPF)的白来航鸡攻毒组100只和对照组50只。攻毒组个体腹腔注射MDV-GA(2 000 PFU)国际标准毒株0.2 mL，对照组注射同等剂量的无病毒稀释液。两组鸡分别饲养在不同的负压隔离器中，其他试验条件一致，试验持续56 d。在感染MDV的30～56 d，一共有47只鸡体内发生肿瘤。在感染后31～55 d，连续观察鸡群状态，对表现为严重病症的个体进行屠宰，同时屠宰未感染对照组个体。个体屠宰后收集脾脏、肝脏和各组织来源的MD淋巴瘤。所有组织均保存在RNA保存液中，置于-80 °C用于RNA的提取。

1.2 miRNA靶基因的生物学功能分析

利用在线软件miRDB(Http://www.mirbase.org)和TargetScan(Http://www.targetscan.org/)对gga-miR-29b-3p的潜在靶基因进行生物学预测，得到两者预测的共同靶基因，作为候选靶基因。然后，在DAVID平台(Https://david.ncifcrf.gov)对预测出的候选靶基因进行GO和KEGG分析。

1.3 细胞培养和miRNA转染

MDV转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1培养条件是利用含有10%胎牛血清(Invitrogen公司)的RPMI-1640培养基，置于温度37 ℃，湿度95%,含有5% CO的培养箱中。FuGENE HD 转染试剂(Promega公司)用于miRNA转染，用于转染的miRNA激动剂(Agomir)和阴性对照(Negative control, NC)剂量分别为100 nmol/L。Gga-miR-29b-3p agomir和NC试剂均购于上海吉玛公司。

1.4 RNA提取和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

利用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取冰冻组织或细胞总RNA。利用cDNA synthesis kit(miRACLE公司)反转录miRNA，qPCR miRNA kit(miRACLE公司)用于miRNA的定量检测, 每组8个样本。用于检测内对照5S的上游引物序列为5'-ACCGGGTGCTGTAGGCTTAA-3'；检测gga-miR-29b-3p的上游引物序列为5'-CGTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTA-3'。反应条件为95 °C预变性10 min，95 °C变性10 s，57 °C退火20 s，72 °C延伸1 min，在ABI 7500仪器(Invitrogen公司)上进行40个循环。

利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen公司)将总RNA反转录为cDNA用于基因表达水平的检测。使用Power SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogen公司)进行qRT-PCR检测，每组3个生物学重复。

β

-

actin

、

MMP2

、

MMP9

和

Meq

基因的引物信息参照之前发表的文章。以5S和β-actin为内参基因，通过2方法计算基因的相对表达量。

1.5 统计分析

所有数据的表达形式为平均值±标准误。利用SAS(9.0版本)软件按照t检验进行统计分析。当

P

<0.05时表示数据之间差异显著；当

P

<0.01时表示数据之间差异极显著。

2 结果与分析

2.1 Gga-miR-29b-3p在MD肿瘤化组织和未感染组织中的表达

Gga-miR-29b-3p在马立克氏病肿瘤化组织和未感染组织中的表达量见图1。与未感染组脾脏相比较，Gga-miR-29b-3p的表达量在肿瘤化脾脏中显著下调(

P

<0.05)；与未感染组肝脏相比，Gga-miR-29b-3p在肝脏淋巴瘤中的表达也呈现显著性下调(

P

<0.05)(图1)。结果提示该miRNA在马立克氏病肿瘤化组织中表达下调。

注：NS为未感染脾脏；TS为肿瘤化脾脏；NL为未感染肝脏；LL为肝脏淋巴瘤。n=8,P<0.05。图1 肿瘤化组织和未感染组织中gga-miR-29b-3p的表达水平Fig.1 Differential expression of gga-miR-29b-3p in tumourous and non-infected tissues

2.2 Gga-miR-29b-3p的潜在靶基因功能分析

2.2.1 Gga-miR-29b-3p的潜在靶基因GO注释 GO(Gene Ontology, http://www.geneontology.org/)数据库可以将基因按照其参与的生物学过程、构成细胞的组分和实现的分子功能等进行分类。分别利用miRDB和TargetScan对gga-miR-29b-3p的靶基因进行生物学预测，对预测得到的靶基因进行GO注释(图2)。结果显示gga-miR-29b-3p的预测靶基因可以参与生物过程(Biological process, BP)中的胞内信号转导、肽类丝氨酸磷酸化和染色质重组过程，细胞成分(Cellular component, CC)中的细胞外基质、SNARE复合体和NuA4组蛋白乙酰转移酶复合物，分子功能(Molecular function, MF)中的丝氨酸/苏氨酸激酶活性、SNAP受体活性和SNARE结合。

图2 Gga-miR-29b-3p预测靶基因的GO和KEGG分析

2.2.2 Gga-miR-29b-3p的潜在靶基因KEGG信号通路注释 KEGG库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes 数据库)是系统分析基因功能、联系基因组信息和功能信息的知识库。对gga-miR-29b-3p的预测靶基因进行KEGG通路分析(图3)。结果显示gga-miR-29b-3p的潜在靶基因聚集在FoxO信号通路、胰岛素抵抗、孕激素介导的卵母细胞成熟、mTOR信号通路、细胞凋亡、ErbB信号通路、Toll样受体信号通路、甲型流感、VEGF信号通路、Jak-STAT信号通路和胰岛素信号通路。

图3 Gga-miR-29b-3p对MMP2和MMP9表达的影响

2.3 Gga-miR-29b-3p对侵袭相关基因MMP2和MMP9表达的影响

肿瘤细胞具有侵袭的特点，进一步分析了gga-miR-29b-3p对MSB1细胞侵袭的影响。在MSB1中过表达gga-miR-29b-3p，侵袭相关基因

MMP2

和

MMP9

的表达量都发生显著性下调(

P

<0.05)。结果提示gga-miR-29b-3p可以抑制侵袭相关基因的表达(图4)。

图4 Gga-miR-29b-3p对Meq表达的影响

2.4 Gga-miR-29b-3p对MDV原癌基因Meq表达的影响

Meq

基因是MDV中重要的原癌基因，对于病毒的潜伏存在和维持病毒的致癌性具有重要作用。本项目分析了gga-miR-29b-3p对于

Meq

基因的表达水平是否有影响。结果显示在MSB1细胞中转染该miRNA，过表达后的48 h，

Meq

基因表达量显著下调(

P

<0.05)，过表达后的24和72 h，

Meq

表达量没有显著变化。结果提示gga-miR-29b-3p在一定程度上可以抑制病毒原癌基因的表达。

3 结论与讨论

通过高通量测序，研究发现gga-miR-29b-3p在MD肿瘤化脾脏和肝脏淋巴瘤中的表达量很低，实时荧光定量PCR检测的结果也证实了这一发现。为了进一步分析gga-miR-29b-3p在MD肿瘤组织中异常表达的原因，我们利用在线软件预测该miRNA的靶基因，并分析其靶基因参与的生物功能过程和相关的信号通路。结果显示gga-miR-29b-3p的潜在靶基因涉及的信号通路大多与细胞增殖有关，其中FoxO、mTOR、ErbB和Jak-STAT信号通路能够调节细胞分化、周期、凋亡和自噬等过程。gga-miR-29b-3p的靶基因或许能通过参与细胞增殖、免疫反应等过程影响MD的肿瘤转化。转录因子FoxO亚族在许多肿瘤疾病中扮演肿瘤抑制因子的角色。FoxO在患有横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤等病例中表达异常，PI3K和MAPK信号通路能够使其失活，并且多种肿瘤相关miRNAs能够抑制FoxO的表达。在细胞凋亡过程中，FoxO激活Fas、TNF、Bcl-XL、bNIP3和Bim等死亡受体配体基因的表达。在多种癌症中发现能与FoxO结合的至关重要的信号通路是PI3K/AKT/mTOR，FoxO还能与Ras-MEK-ERK、IKK和AMPK信号通路结合参与肿瘤发生。自嗜参与肿瘤与其所处微环境平衡之间的调节，PI3K/AKT/mTOR信号通路是自嗜的一个调节环节，参与间质与肿瘤之间的互作，与多种肿瘤发生和病理发展进程密切相关，肿瘤的基因病变能够引起mTOR信号转导异常。mTOR的过度激活会引发细胞增殖和代谢加速，从而促进肿瘤的发生和发展。ErbB在嗜铬细胞瘤、副神经节瘤和腺癌中表达异常升高，可以作为肿瘤发生的指示物。Jak-STAT信号通路通常在肿瘤发生和迁移进程中发生异常，该通路能够介导肿瘤细胞识别和肿瘤引发的免疫逃逸，该通路激活后靶向下游原癌基因、miRNAs和其他共调节因子，发挥抗肿瘤作用。其中STAT1和STAT2诱导I型、II型干扰素以及下游干扰素的释放，发挥抗肿瘤作用。然而，STAT3却与肿瘤微环境中的癌细胞存活、免疫抑制和持续炎症反应密切相关。所以该通路是肿瘤发生的一把“双刃剑”。在感染MDV的细胞中，病毒通过激活STAT3蛋白阻断ATR-Chk1信号通路，从而利于自身的病毒复制，引发DNA损伤。目前，FoxO、mTOR和Jak-STAT信号通路是许多肿瘤疾病治疗方案中比较有效的靶点。原癌基因、生长因子和缺氧能够引起血管内皮生长因子VEGF异常高表达，而VEGF在肿瘤血管形成中起到关键作用。Toll样受体已被认为是参与肿瘤发病机理的关键因素，可以在肿瘤微环境中重编程细胞代谢，调节肿瘤细胞以及肿瘤浸润的先天性和适应性免疫细胞。Toll样受体配体是制备许多传统疫苗的佐剂，而且也有研究证明该基因可以提高肿瘤免疫疗法的效率。

Fang等针对Meq附近编码的miRNA设计miRNA sponge，分析其对MD肿瘤发生的影响，结果显示miRNA sponge能显著性抑制MSB1细胞的增殖和侵袭能力。同时利用SPF鸡进一步进行体内验证，注射含有MSB1细胞悬液的鸡能够引发肿瘤，而注射miRNA sponge不会诱发肿瘤，还能缓解MSB1引发的生长抑制，说明miRNA sponge可作为抑制MD肿瘤发生的一种小分子，在疾病治疗方面具有很大潜力。通过体内系统给予miR-29b能显著抑制肿瘤血管化和肿瘤细胞活性，从而抑制肿瘤生长并不产生毒性。Perepelyuk等将miR-29b加载到MUC1配体功能化的纳米粒子中，能够提高miR-29b对肿瘤细胞的靶向性。在胃癌细胞中，miR-29b/c靶向DNMT3a，反之DNMT3a以DNA甲基化依赖性的方式抑制miR-29b/c表达。而miR-29b/c和DNMT3a下调能促进胃癌细胞迁移，这表明miR-29b/c也许能作为胃癌治疗的靶点。Gga-miR-29b-3p在感染MDV的肿瘤组织中低表达，MSB1细胞是由感染MDV BC-1毒株引发的脾脏淋巴瘤制备的细胞系，在该细胞中过表达gga-miR-29b-3p显著抑制细胞的侵袭能力，提示这个miRNA或许在MD发病进程中发挥重要作用，可以抑制MD肿瘤转化。侵袭是肿瘤细胞转化的重要特征，

MMP2

和

MMP9

能够降解IV型胶原蛋白，影响细胞的侵袭。通过检测发现，在MSB1细胞中，高表达的gga-miR-29b-3p能够显著抑制

MMP2

和

MMP9

的表达。原癌基因

Meq

在MD肿瘤组织和淋巴瘤来源的T淋巴母细胞中持续高表达。在感染MDV过程中，

Meq

基因在溶细胞感染和潜伏感染阶段表达。在MSB1细胞中过表达gga-miR-29b-3p能够抑制

Meq

基因的表达，提示MD肿瘤组织中该miRNA的异常低表达或许能够增强病毒的原癌性。综上所述，作为在MD肿瘤组织中异常低表达的miRNA，gga-miR-29b-3p或许能通过调节潜在靶基因的表达影响细胞增殖、周期、凋亡和自嗜，并且该miRNA可以影响肿瘤细胞的侵袭能力和病毒原癌基因

Meq

的表达，表明该miRNA的异常表达可以反映MD的肿瘤转化进程。