洪盛威， 杨 尧， 徐丁林， 曹千千， 印慧琳， 夏泽远， 丁 康*

(1.南京中医药大学 附属南京中医院，江苏 南京 210029;2.北京大学第一医院，北京 100034)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)为革兰氏阴性微需氧菌，是消化系统的主要致病菌之一。目前,其病因和致病机制尚未完全阐明，可能的影响因素主要包括社会心理因素、遗传、感染、食物、药物等。致病机制可能与免疫系统异常、炎症反应激活有关，其中慢性炎症被认为是Hp感染所致胃肠道疾病过程中的关键因素，Hp和其他细菌通过激活相关信号通路，导致炎症相关靶点的高表达与促炎细胞因子的释放。Hp感染可在胃的恶劣条件下持续数十年。这是通过独特的进化适应来实现的，包括使用多种外膜蛋白来粘附胃上皮上的聚糖部分等。

荆花胃康胶丸(JinghuaWeikang capsule，JWC)是国家食品药品监督管理局批准的用于胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性胃炎和抑制Hp引起的疾病的专利药(Z10970067)，由土荆芥和水团花中提取的挥发油按一定比例组成，临床使用效果良好。既往研究通过临床疗效或动物模型方法探讨了JWC对Hp诱导的炎症反应的保护机制，但其疗效的物质基础和分子机制尚不明晰，单目标或单成分的常规方法难以解决这一复杂问题。

系统药理学方法凭借其整体调控，多层次、多组分、多靶点的特点，为多参数代谢应答提供了工具。该方法由网络药理学、虚拟筛选、生物信息学等相关工具组成，近年来在中医药研究中备受青睐。血型抗原结合粘附素(Blood group antigen binding adhesin，BabA)是第1个被发现并确认的Hp粘附素，它包含两个域：一个N端胞外宿主结合域和一个C端跨膜外域(图1)。BabA通过结合在胃上皮细胞和粘蛋白上发现的岩藻糖基化组织血型抗原来介导Hp附着。抑制粘附素即开发粘附素的抑制剂可阻碍细菌粘附，基于BabA的空间构象寻找抑制Hp粘附的天然物质具有重要意义。

图1 血型抗原结合粘附素(BabA)的三维结构

本研究旨在以全构建的JWC活性成分和巨型分子靶点网络为基础，采用系统药理学方法，研究JWC对Hp诱导炎症反应的干预机制，并将筛选所得先导化合物与BabA靶点进行对接，从分子水平探讨JWC对Hp粘附的抑制机制。这种新方法将增强对JWC干预Hp所致炎症反应物质基础与分子机制的认识，并为JWC的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 JWC中活性成分数据的采集

JWC是由土荆芥(黎科黎属植物，

Chenopodium

Ambrosioides

L.)及水团花(茜草科水杨梅属植物，

Adina

rubella

Hance)中提取的挥发油按一定比例组成，目前各大中药成分数据库并未收录其化学成分。研究表明，土荆芥、水团花挥发油中主要为萜类成分，故结合现有文献资料进行数据挖掘、整理，收集2味中药中具有化学结构的萜类成分。利用Chem Office(2016)软件绘制JWC所含化合物的分子式，保存为SDF(.sdf)格式文件。采用Schrödinger(2018)平台的QikProp模块预测JWC所含化合物的药代学参数，包含QPPCaco，QPlogKhsa，OB等3个方面，筛选掉不符合ADME标准的化合物。

1.2 阳性药与候选活性分子的主成分分析

为探究JWC候选活性分子的类药性，从Drug Bank数据库中收集整理了FDA已批准上市的Hp根除三联疗法药效分子。利用Schrödinger(2018)平台中Canva 3.9模块，进一步计算阳性药与TWC候选活性分子的270个重要描述符，以此反映小分子的理化性质及药代学特征。采用R语言factoextra和FactoMineR包进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，研究土荆芥、水团花所含候选活性化合物的类药性。PCA是简化分子描述符的统计学方法，它能将阳性药与候选活性分子映射到平面象限中，每一个坐标点表示一个化合物，坐标点之间的间距反映分子的相似性，从而直观表现JWC中的候选活性分子与阳性药的近似度。

1.3 阳性药抗Hp感染靶点获得与分子对接验证

通过PharmMapper Server(Http://59.78.96.61/pharmmapper/)，Swiss Target Prediction (Http://www.swisstargetprediction.ch/)平台对三联疗法治疗Hp感染相关疾病的潜在靶点进行预测。通过OMIM(Https://omim.org/)、Genecards(Https://www.genecards.org/)和DisGeNET(Https://www.disgenet.org/)3大数据库收集Hp感染相关疾病靶点。并将阳性药物作用靶点与Hp感染相关靶点取交集，最终获得三联疗法对Hp感染的生物治疗靶点，并从PDB数据库中获取相应靶点蛋白晶体结构文件用于下一步实验。

为了探究JWC活性化合物与Hp感染相关靶点的关系，选用Schrödinger(2018)进行JWC药效分子基于三联疗法抗Hp感染靶点的计算机辅助虚拟筛选。首先，将靶点结构导入Protein Preparation Wizard模块进行蛋白结构优化，包括删除所有的结晶水分子，纠正带有缺失原子的侧链，添加氢原子，并使用OPLS3力场分配质子化态和部分电荷。将晶体结构能量最小化，直到非氢原子的均方根偏差(RMSD)达到0.3 Å。之后，采用LigPrep模块优化34个候选活性分子，在pH 6.8～7.2之间生成小分子的电离和互变异构状态。使用OPLS3力场使小分子能量最小化，最大立体异构体数目设置为32。最后，采用Receptor Grid Generation 模块生成用于对接的晶格文件。使用Glide模块进行分子对接，方法精度采用extra precision (XP)。记录对接评分，借助R语言的pheatmap包构建分子对接结果的聚类分析热图，进行对接评分可视化处理。本研究运行系统为Windows 10，并搭载GTX 1050 Ti显卡，显存8G。

1.4 “药效分子-疾病靶点”网络构建与分析

将筛选获得的JWC药效分子连同其各自对应的靶点上载至Cytoscape 3.7.1软件，构建“药效分子-疾病靶点”网络图，从整体水平上表现JWC治疗Hp感染的作用机制。借助插件Network Analyzer对网络图的拓扑学参数进行分析，涉及度中心度(Degree Centrality，DC)、接近中心度(Closeness Centrality,CC)、中介中心度(Betweenness Centrality,BC)等多项参数。结合研究特点，将关键目标评价指标定义为“目标重要性(TI)”，可以根据以下公式计算。其中，DCi、CCi和BCi分别表示目标i的度中心度、接近中心度和中介中心度。DCmax、CCmax和BCmax分别是模块各指标的度中心度、接近中心度和中介中心度之间的最大值。更大的TI值表明节点在拓扑网络中更重要。

1.5 KEGG通路富集分析

借助Cytoscape 3.7.1软件中的CluoGO插件，把网络图中的关键靶点映射到生物学通路中，在通路水平上阐释关键靶点与JWC抗Hp作用机制的潜在联系。除物种类别设置为人源性选项之外，其余参数选项值均为默认值。借助Omicshare云平台(Https://www.omicshare.com/)，进行数据可视化处理。

1.6 水团花化合物的分子对接分析

为证实水团花所含化合物对黏附素BabA的竞争性抑制作用，将Lewisb结合在BabA中的位置设置为待对接分子的结合位点，探究水团花所含化合物与BabA的结合效应。将BabA(PDB ID:4ZH7)靶点结构导入Protein Preparation Wizard模块，对接步骤参照1.3节，并构建活性化合物与BabA的相互作用图。

2 结果与分析

2.1 活性成分的ADME筛选与主成分分析

通过对JWC中活性成分的数据挖掘，从2味中药土荆芥、水团花中分别得到23、37个萜类化合物。以QPPCaco≥25，QPlogKhsa介于±1.5之间，OB≥25%作为筛选标准，最终获得土荆芥成分23个，水团花成分11个，作为JWC的候选活性化合物。收集FDA批准的Hp根除三联疗法阳性药(表1)，之后34个活性成分和12个阳性药物被装载到Schrödinger(2018)平台中Canvas模块，计算出大约270个分子描述符，涉及物理化学、拓扑学等多个方面的信息，并进行PCA可视化分析，比较JWC候选活性分子与Hp根除三联疗法阳性药的空间分布差异(图2)。X和Y轴分别代表两个主成分，包含90%的化学描述符信息。结果表明土荆芥分子集合与三联疗法阳性药在空间位置的重叠性较高，而水团花分子集合与阳性药差异则较大，提示土荆芥分子较水团花具有更好的类药性。

表1 FDA批准的12种治疗Hp的药物

图2 主成分分析的Dim2-Dim1图

2.2 药效成分潜在靶点预测与分子对接验证

通过PharmMapper、DrugBank和SwissTargetPrediction数据库共鉴定950个阳性药反向匹配靶点，如Tumor necrosis factor(TNF，P01375)，Mitogen-activated protein kinase 14(MAPK14，Q16539)，Mitogen-activated protein kinase 8(JNK1，P45983)等。另外，根据OMIM、Genecards和DisGeNET数据库获得了1 914个Hp感染相关基因。将阳性药反向匹配所得靶点与Hp感染相关靶点取交集，获得映射靶点251个，取基于相关性评分大于30的靶点作为三联疗法对Hp感染的生物治疗靶点，共计22个。

在确定蛋白靶点的结合位点后，首先选择每个靶点与其自带阳性配体进行对接，以验证对接筛选的科学性。完成全部的对接模拟后，记录JWC中34个候选活性分子与22个疾病靶点互作的对接打分。由于版面有限，本研究省略了详细的对接结果，仅提供了34个候选活性分子与22个疾病靶点的聚类分析热图(图3)。对接打分显示在色块中央，得分绝对值越高，色块颜色越深，代表分子与靶点的结合效应越好。绝大多数候选活性分子与疾病靶点形成较好相互作用，这些靶点可能是JWC治疗Hp感染的关键靶点。Hp感染引起的各类胃肠道疾病并非单个靶点表达的引起，而是复杂过程作用的结果，因此本研究的模拟结果将有助于解释JWC对Hp感染有良好临床疗效的原因。

图3 分子对接的聚类分析热图

2.3 “药效分子-疾病靶点”网络构建与分析

选取2.2节对接结果中具有较高的结合能(Docking score<-6 kcal/mol)的JWC候选活性成分与靶点，借助Cytoscape软件构建“药效分子-疾病靶点”拓扑学网络，并计算网络模型的拓扑学参数，获得网络节点的BC，DC及CC，确定各节点的TI值(表 2)。节点的面积、颜色与TI值呈正相关，节点的面积越大，颜色越深，表明此靶点在网络关系中越重要；节点间连线的粗细与Docking score比例固定，连线越粗则表示靶点与小分子结合能越高(图 4)。模型显示JWC所含13个药效分子与8个靶点之间存在着复杂关系，这个复杂关系网络同样印证了JWC通过“多分子、多靶点”来发挥其效用的论断。将8个疾病靶点定义为JWC治疗Hp核心靶点，分别为TAK1、TAB1、RELB、MAPK14、MAPK11、JNK1、IKKB和ERK1，主要与炎症过程有关。分析结果筛选出13种关键药效分子主要来自于土荆芥，均有不同程度的抗炎、杀菌作用，依次为19. Bornylene；20. P-Cymene；21. Alpha-Terpinene；22. Menthol；24. Trans-pinocarveol；27. Carvacrol；28. 3-Carene；29. Benzene,(2-Methyl-1-propenyl)；31. Diosphenol；33. Pinocamphone；34. Thymol；49. Quinovic acid-3β-O-(3',4'-O-isopropylidene)-β-D-fucopyranoside；70. Pyrocincholic acid 3β O-β-D-fucopyranoside。

表2 8个主要靶点的节点的网络特性

图4 JWC治疗HP的“药效分子-疾病靶点”网络

2.4 KEGG通路富集分析

基于2.2节获得的22个三联疗法对Hp感染的生物治疗靶点，本节使用Cytoscape 3.4.0的插件ClueGO进行KEGG通路富集分析，映射KEGG通路28条(

P

<0.01)，包括NF-kappa B信号通路(NF-kappa B signaling pathway)，MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)，癌症相关通路(Pathways in cancer)，TNF信号通路(TNF signaling pathway)，HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等(图5)。将28条信号通路按照富集靶点数进行排序，其中NF-kappa B信号通路和MAPK信号通路富集靶点数最多，分别为14、12个，推断JWC药效分子可能主要通过作用于NF-kB/MAPK信号合成或转运通路干预Hp所致炎症反应。

图5 22个主要疾病靶点的KEGG通路富集分析

2.5 水团花成分与BabA的分子对接

对接结果显示，化合物70，71，41与BabA有较高的预测结合自由能(Docking score<-6 kcal/mol)。相互作用分析发现，化合物70与BabA的氨基酸C189，N194，N195，Q207和T246形成氢键相互作用(图6)；化合物71与BabA的氨基酸C189，G191，N194，N195，Q207和T246之间存在氢键相互作用(图7)；化合物41与BabA的氨基酸G191存在两个氢键相互作用，与K208和T246分别形成一个氢键相互作用(图8)。其中氨基酸C189，N194，T246，G191为70，71，41号化合物与Lewisb作用于BabA的共同氨基酸。

图6 70号化合物和BabA的对接示结果

图7 71号化合物和BabA的对接示结果

图8 41号化合物和BabA的对接示结果

3 结论与讨论

JWC由土荆芥和水团花组成，其主要作用是理气散寒、清热化瘀、和胃止痛，临床用于治疗胃、十二指肠溃疡，见于寒热夹杂证型。由于JWC成药主要为其原料药提取挥发油中的萜类成分，故本研究基于系统药理学对JWC萜类成分进行了虚拟筛选，并对其干预炎症反应的药理机制进行了初步探讨。

萜类广泛分布于植物、昆虫、真菌和海洋生物中，因表现出诸多生物活性而受到了广泛关注，成为了治疗重大疾病的天然药物，例如抗癌药物紫杉醇、抗疟疾药物青蒿素以及抗生素类药物穿心莲内酯等。本研究从土荆芥、水团花所含萜类成分中筛选得到13个关键药效分子，包括19. Bornylene；20. P-Cymene；21. Alpha-Terpinene；22. Menthol；24. Trans-pinocarveol；27. Carvacrol；28. 3-Carene；29. Benzene,(2-Methyl-1-propenyl)；31. Diosphenol；33. Pinocamphone；34. Thymol；49. Quinovic acid-3β-O-(3',4'-O-isopropylidene)-β-D-fucopyranoside；70. Pyrocincholic acid 3β O-β-D-fucopyranoside。其中多数药效分子来自土荆芥，占较大权重(11/13)。究其原因，只因JWC中主要成分水团花对Hp菌株的抑菌作用并不明显，其主要具有抑菌药效的成分为土荆芥。张恩恩等通过建立体外Hp的生物膜模型，证实土荆芥提取物在体外对于Hp菌株的生物膜形成具有抑制作用。此次筛选出的11个土荆芥中萜类分子在中草药及天然产物中分布广泛，如20.P-伞花烃(P-Cymene)、香芹酚(27. Carvacrol)就很有代表性。香芹酚是精油的主成分及香料的原料，对Hp具有抗菌效果。P-伞花烃本身对革兰氏阴性菌并无抑制作用，其药效作用体现在与抑菌剂的协同作用上。研究表明，P-伞花烃与香芹酚同时存在可提高挥发油的抑菌活性。本研究运用计算机辅助虚拟筛选，分析得到土荆芥为JWC抑菌作用的主要中药，这与相关药理学研究结果基本吻合。但并不能因此否定水团花治疗Hp感染的临床疗效，其药效作用的实现可能通过其他途径。

PCA结果显示，水团花所含化学成分类药性不高，且分子对接显示其未与Hp感染潜在治疗靶点形成较强相互作用。研究表明，粘附素BabA在Hp致病过程中起关键作用，易与多糖发生结合从而抑制BabA黏附在胃壁上，而水团花所含化合物中富含多糖。因此，我们推测水团花所含化合物可能通过抑制Hp黏附作用发挥抗Hp疗效。2015年Franco等研究了BabA结合Lewisb抗原的结构基础(PDB ID:4ZH7)，基于此研究将Lewisb结合在BabA中的位置设置为待对接分子的结合位点，将水团花所含的主要化合物成分与BabA进行了分子对接研究。结果显示，化合物70、71、41所含多糖可竞争性地与BabA位点形成稳定结合，从而阻止Hp粘附在胃壁上。由此推测70、71、41号化合物有望成为BabA的竞争性抑制剂，水团花可能通过竞争性抑制黏附素BabA发挥抗Hp疗效。

KEGG通路富集分析表明，22个三联疗法对Hp感染的生物治疗靶点共映射至28个通路，其中NF-kappa B和MAPK信号通路富集靶点数最多，提示这两条通路在JWC治疗Hp感染中占有重要地位。现有研究表明，NF-kappa B和MAPK信号通路参与Hp感染诱导的基因表达和宿主应答。Hp感染者几乎均存在不同程度的胃黏膜炎性反应，NF-kappa B作为重要的多功能核转录因子，在Hp感染者的胃黏膜组织中表达明显上调。Shi等通过构建Hp感染小鼠模型，证实了JWC可能通过NF-kappa B信号通路干预Hp诱导的炎症反应。MAPK信号通路目前已经成为多种炎症疾病研究靶点，p38MAPK是MAPK通路中至关重要的信号转导通路，Hp等多种应激原通过激活p38MAPK启动机体的一系列分子反应，促使p38MAPK蛋白磷酸化后入核，经过一系列信号转导最终加剧炎症的发生。张梦薇证实头花蓼可通过抑制p38MAPK磷酸化水平，缓解炎症的发生从而达到治疗Hp感染胃炎的目的。因此，从KEGG生物学通路富集分析中可以看出，JWC的药效分子可能主要通过作用于MAPK/NF-kB信号合成或转运通路来干预Hp感染引起的炎症反应，土荆芥在这一作用中占主导地位。

综上所述，本研究借助ADME筛选、PCA、计算机辅助虚拟筛选等手段，对JWC的主要成分土荆芥、水团花的药理机制进行了初步探析。结果表明，土荆芥可能通过干预MAPK/NF-kB信号通路发挥抗Hp作用，而水团花的药效作用体现在竞争性抑制黏附素BabA从而阻止Hp黏附在胃壁上。JWC可通过调控黏附素-MAPK/NF-kB信号通路干预Hp感染所致炎症反应。此外，本研究筛选出14个关键药效分子，可凭借药物化学手段进行结构修饰或改造，最终为单用或联合用药提供更多的药物来源。但由于虚拟筛选的的局限性，例如未能考虑中药浓度与小分子代谢对药效的影响，后续仍需开展更多的实体药效学验证试验。