万 兵，王 鹤

（广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科，南宁 530021）

子宫颈癌（cervical cancer，CC）仍是最常见的妇科恶性肿瘤，在全球女性肿瘤的发病率和死亡率均居第四位[1]。宫颈癌中约99.7%以上存在人乳头状瘤病毒DNA，高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持续感染是宫颈上皮内病变（squamous intraepithelial lesion，SIL）及宫颈癌发生的主要致病因子。但并不是所有的宫颈HPV感染者都会朝着宫颈癌变的方向进展[2]。除高危型HPV持续性感染外，宫颈微环境中的微生物群落的变化在对宫颈癌前病变（CIN）进展及宫颈癌的发生中也起着十分重要的作用。在宫颈上皮细胞癌变过程中，可能存在其他致癌因素或协同HPV作用的因素，增加宫颈上皮细胞感染HPV 的易感性，导致HPV持续存在最终发生癌变，但这种致癌作用的潜在机制大部分仍然不清楚[3]。这些致癌因素包括遗传因素、环境因素、细胞防御、免疫功能，以及特定于机体的基因和细胞因子[4]。

阴道是一个相对密闭、缺氧和定植着多种菌群的微生态环境，而宫颈阴道部直接暴露在阴道微生态环境中。本课题组前期研究发现，乳酸杆菌是阴道中最主要的优势菌，可占90%左右[5]，与其他微生物共同构筑起人体黏膜微生物屏障，其在拮抗多种病原菌、维持阴道微生态平衡和抑制肿瘤的发生发展等方面发挥重要的作用。鉴于乳酸杆菌作为定植于人体黏膜上的益生菌，卷曲乳酸杆菌又是其中检出率最常见菌种之一。因此，本研究采用卷曲乳酸杆菌与宫颈鳞癌细胞（SiHa细胞）共培养，探讨其抗肿瘤作用，以期为预防和治疗宫颈癌提供新的策略和理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系与细菌 宫颈鳞癌细胞株SiHa 由上海交通大学第九人民医院赠送，经STR鉴定与SiHa细胞完全匹配（EV 值为1.0），在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 g/mL 链霉素的DMEM培养基（美国Gibco公司）中培养。卷曲乳酸杆菌（CGMCC：1.2743）购自中国科学院微生物研究所，在MRS 固体/液体培养基（北京索莱宝公司）分离和增菌培养，置于厌氧培养箱中。

1.2 共培养体系的建立 以5×105个/孔的细胞密度将SiHa 细胞接种于6 孔板，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h 后，弃去原培养液，PBS 清洗2 次，再加入无青―链霉素含10%FBS 的DMEM 培养液。卷曲乳酸杆菌在MRS液体培养基中厌氧培养48 h后，用无抗生素含10% FBS 的DMEM 培养液重悬，按细菌∶细胞=200∶1（即感染复数=200）加入每孔细胞中，在细胞培养箱中共培养24 h，分别在6 h、12 h、18 h、24 h 显微镜下观察细胞生长情况。以培养24 h 后未加卷曲乳酸杆菌的SiHa 细胞及细胞上清液作为对照组，记为0 h。

1.3 CCK-8法检测共培养前、后的细胞活力 SiHa细胞以5×103个/孔接种于96孔板，每个检测时间点设置3 个复孔，培养24 h 后更换为无青－链霉素的培养基，按感染复数=200加入卷曲乳酸杆菌，混匀，在含5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。检测前弃去原培养液，然后向每孔加入100 μL无青－链霉素含10%FBS的DMEM培养基及10 μL CCK-8试剂，避光培养2 h。正常组的空白孔为不含卷曲乳酸杆菌的新鲜培养液，共培养组的空白孔为含有等量卷曲乳酸杆菌的无抗生素新鲜培养液。用酶标仪检测各孔在450 nm 波长处的吸光度（OD）值，并减去同组的空白孔OD值，绘制细胞增殖曲线。

1.4 流式细胞术检测SiHa 细胞凋亡 收集正常组（未加卷曲乳酸杆菌）、阳性对照组（加入30 μg/mL顺铂并培养48 h）及与卷曲乳酸杆菌共培养6 h、12 h、18 h 及24 h 的细胞上清液。用不含EDTA 的胰酶消化SiHa 细胞，与同孔细胞上清液混合后离心，弃去上清，加入100 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞，分别加入5 μL PI和5 μL FITC染料，冰上避光反应15 min 后再分别加入200 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞，200 目过滤网过滤后，用CytoFLEX 流式仪检测细胞凋亡。

1.5 细胞上清液中白细胞介素（IL）-2含量检测

收集正常组和与卷曲乳酸杆菌共培养6 h、12 h、18 h 和24 h 的细胞上清液，2 000 r/min 离心15 min 后收集上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组细胞上清液中IL-2含量。检测过程严格按照试剂盒（武汉Elabscience 公司）说明书进行操作。

1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测增殖细胞核抗原（PCNA）基因表达量 收集细胞，Trizol法提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，进行PCR 扩增。PCR 反应条件：95 °C 预变性30 s；95 °C 变性5 s，60°C 退火、延伸34 s，共循环40 次。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算PCNA相对表达量。引物序列如下：PCNA上游：5’-TCCATCCTCAAGAAGGTGTT-3’，下游：5’-GGTAGGTGTCGAAGCCC-3’；GAPDH 上 游：5’-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3’，下游：5’-CACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 卷曲乳酸杆菌对SiHa 细胞形态的影响 正常组的SiHa 细胞体积较大，形态饱满，呈梭形或多边形，细胞核大，并可见较多处于分裂的细胞；加入卷曲乳酸杆菌共培养后，大量的卷曲乳酸杆菌黏附在SiHa细胞膜外，细胞体积逐渐缩小，形态变圆，细胞间隙逐渐增大，漂浮和死亡的细胞明显增多，贴壁细胞明显减少，见图1。

图1 卷曲乳酸杆菌对SiHa细胞生长形态的影响（200×）

2.2 卷曲乳酸杆菌对SiHa 细胞增殖的影响 与正常组比较，共培养组在12 h后SiHa细胞增殖被显著抑制（P＜0.001），见图2。

图2 卷曲乳酸杆菌对SiHa细胞增殖的影响

2.3 卷曲乳酸杆菌对SiHa 细胞凋亡的影响 共培养6 h、12 h、18 h 和24 h 的细胞较正常组细胞凋亡率显著增高（均P＜0.01），阳性对照组细胞凋亡率显著高于共培养组（P＜0.001），见图3。

图3 卷曲乳酸杆菌对SiHa细胞凋亡率的影响

2.4 卷曲乳酸杆菌作用SiHa细胞不同时间后上清液中IL-2 含量变化 与正常组比较，IL-2 分泌量在共培养6 h 和12 h 显著升高（P＜0.001），在共培养18 h 降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），共培养24 h显著下降（P＜0.01），见图4。

图4 卷曲乳酸杆菌作用SiHa细胞不同时间后上清液中IL-2含量变化

2.5 PCNA 基因在共培养前后的表达变化 与卷曲乳酸杆菌共培养6 h、12 h、18 h、24 h的SiHa细胞PCNA mRNA 相对表达量分别为0.650±0.147、0.430±0.226、0.212±0.241、0.242±0.081，与正常组（1.027±0.272）比较，在共培养12 h 开始显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

乳酸杆菌的抗肿瘤作用的机制是多方面的，既可以通过激活宿主的免疫系统，也可以通过产生胞外多糖、细菌素等发挥抗癌作用。Shiomi 等[6]研究发现，发酵乳中的乳酸杆菌，其产生的胞外多糖在活的生物体内同样具有抗肿瘤活性。不同属、种、株的乳酸菌都能分泌出不同的细菌素，具有很好的抗肿瘤效果。乳酸杆菌激活宿主免疫系统的途径包括诱导IL-12、IL-2、IL-4、IFN-γ 等抗肿瘤因子的表达[7]，增强多种免疫细胞的免疫效力[8]，增强树突状细胞对宫颈肿瘤细胞的免疫杀伤能力[9]，激活巨噬细胞及其他免疫细胞。

本研究发现，SiHa细胞加入卷曲乳酸杆菌共培养后，细胞内空亮、体积变小、形态变圆的细胞逐渐增多，漂浮的细胞明显增多。同时，CCK8细胞增殖实验发现，共培养12 h后SiHa细胞生长开始受到显著抑制，细胞凋亡率显著增高（P＜0.05），说明卷曲乳酸杆菌对SiHa 细胞生长有显著的抑制作用。Si-Ha细胞与卷曲乳酸杆菌共培养6 h和12 h后IL-2水平均显著升高（P＜0.05），但随着共培养时间继续延长，SiHa 细胞分泌的IL-2 水平出现了下降，在共培养24 h时IL-2水平显著下降（P＜0.05），此时IL-2的表达下降可能与细胞凋亡和死亡显著增高、活细胞数量大大减少有关。有文献报道，宫颈癌细胞中有IL-2的表达，加入低剂量的IL-2可促进宫颈癌细胞的增殖，而高剂量的IL-2 则表现出抑制作用[10]。宫颈癌细胞分泌的IL-2 可能在免疫逃逸和肿瘤细胞生长方面起着重要作用。本研究结果提示，卷曲乳酸杆菌可刺激SiHa细胞分泌大量的IL-2，大量分泌出的IL-2 可能是抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的重要因素，可能逆转肿瘤细胞微环境中Th1 型向Th2 型细胞因子漂移的现象，后续将进一步研究卷曲乳酸杆菌作用细胞分泌IL-2的机制。

本课题组前期通过生物信息学分析初步筛选发现PCNA 是SIL 发生的差异基因。PCNA 作为细胞增殖的标志蛋白，参与DNA 合成、复制及损伤修复过程，其表达与肿瘤的恶性程度关系密切，PCNA表达越高，细胞增殖分裂的越快[11]。本研究中，宫颈癌SiHa细胞中PCNA表达在加入卷曲乳酸杆菌12 h后显著下降（P＜0.05），PCNA基因降低趋势与细胞生长受抑制的情况一致。表明卷曲乳酸杆菌能通过下调宫颈癌SiHa 细胞的PCNA 表达而抑制宫颈癌SiHa 细胞的增殖。提示卷曲乳酸杆菌在抑制宫颈癌的增殖具有潜在应用价值。本研究中PCNA的差异表达验证了本课题组此前的发现，可作为SIL预警分子靶标。

鉴于益生菌对人体安全无毒，卷曲乳酸杆菌的抗癌研究近年来成为热点。国外研究发现，乳酸杆菌可以靶向定植于实体肿瘤中，而在正常的组织中并未发现其的存在[12]。乳酸杆菌作为兼性厌氧菌，对实体肿瘤有着良好的靶向，可选择性聚集于肿瘤的低氧区域，这为乳酸杆菌在肿瘤基因治疗上提供了临床应用的新方向。Aires等[13]发现，乳酸杆菌可较完整地表达HPV16型的病毒颗粒，并引起小鼠产生HPV16型病毒的抗体，可为乳酸杆菌作为黏膜疫苗用于防治宫颈病变提供重要的理论依据。随着乳酸杆菌的深入研究和应用，可为治疗HPV感染及宫颈病变开辟新的途径，为防治SIL 和宫颈癌提供实验和理论依据。