赵丹华，田艳杰，李秋爽，刘 丽，李翠英，孙静莉

（1.铁岭市妇婴医院妇产科，铁岭 112000；2.北部战区总医院妇产科，沈阳 110016）

宫颈癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，是仅次于乳腺癌的女性第二大恶性肿瘤[1]。宫颈癌患者死亡的重要原因是治疗失败、转移及复发，寻找有效途径提高宫颈癌患者的生存时间是目前亟待解决的问题[2]。非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一类在哺乳动物基因组DNA 中获得的没有编码蛋白质作用的RNA，长链ncRNA（long non-coding RNA，lncRNA）是非编码RNA 中十分重要的一部分，其长度大于200 nt，参与基因印记、染色质修饰、基因表达调控等过程[3]。很多的实验已经发现，lncRNA 的作用广泛，不仅在细胞增殖、代谢、炎症反应等过程中发挥作用，还参与心血管系统疾病、神经退行性疾病、肿瘤等进程[4-6]。lncRNA 在肿瘤组织中表达改变，而且lncRNA 调控肿瘤细胞的迁移和侵袭，对肿瘤患者的康复有重要意义[7]。GA结合蛋白转录因子亚基β1-内含子转录本1（GA binding protein transcription factor subunit beta 1-intronic transcript 1，GABPB1-IT1）是新近研究发现的与肿瘤有关的lncRNA，非小细胞肺癌中GABPB1-IT1表达下调，GABPB1-IT1 能够抑制肿瘤细胞的生长[8]。目前对于GABPB1-IT1 在宫颈癌中的作用还不明确。lncRNA 作用机制与miRNA 关系密切，二者通过碱基互补的方式结合，lncRNA 影响微小RNA（microRNA，miRNA）表达进而发挥多种生物学作用[9]。前期预实验已经发现GABPB1-IT1 和miR-501 存在互补结合位点。miR-501 是一个具有促进肿瘤进展的小分子RNA，在宫颈癌中已经证明miR-501诱导肿瘤转移和生长[10]。本研究探讨GABPB1-IT1对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用及机制，为基因治疗宫颈癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌HeLa、Caski、SiHa细胞购自上海艾研生物科技有限公司；pcDNA-GABPB1-IT1、pcDNA、miR-501 mimics、mimics control 购自和元生物技术(上海)股份有限公司；N-cadherin抗体购自美国Cell Signaling Technology；正常宫颈上皮Ect1/E6E7细胞购自上海钦诚生物科技有限公司；基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）抗体、E-钙粘蛋白（E-cadherin）抗体购自美国Proteintech；MMP-9抗体购自北京义翘神州科技股份有限公司。

1.2 qRT-PCR 方法检测宫颈癌细胞中GABPB1-IT1表达水平

取处于对数生长期的宫颈癌HeLa、Caski、SiHa细胞和正常宫颈上皮Ect1/E6E7 细胞，在细胞中加入Trizol 试剂，提取细胞总RNA。取3 μg 的RNA，加入1 μL 的Oligo dT primer、1 μL 的dNTP，继续加入DEPC 水至10 μL，将上述体系放在65 ℃水浴中孵育5 min，然后置于冰上静置2 min。继续加入4 μL 的5×Prime Script Buffer、1.6 μL Prime Script RTase、0.5 μL 的RNase inhibitor，添加DEPC 水至20 μL，放在42 ℃孵育1 h，95 ℃孵育5min，置于冰上冷却5 min。取50 ng 的cDNA、1 μL 的上游引物以及下游引物、12.5 μL 的SYBR Premix Ex Taq II，加入ddH2O 至25 μL，PCR 反应程序：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，共设置40个循环。以GAPDH作为内参，按照公式2-△△Ct法计算GABPB1-IT1表达水平。引物序列为：GABPB1-IT1 上游（5’-3’）ACCCACAGACAACTGTGGACCC，下游（3’-5’）GCCGCCCCTATTGTTGCCCA；GAPDH 上游（5’-3’）CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA，下游（3’-5’）GGGTGGAATCATATTGGAACATGT。

1.3 实验分组和转染

宫颈癌SiHa 细胞接种到12 孔板，细胞密度达到60%时，进行细胞转染，分别将pcDNA-GABPB1-IT1、pcDNA 转染到细胞内，细胞转染方法按照Lipofectamine 2000 转染试剂说明书进行。把转染pcDNA-GABPB1-IT1、pcDNA 后的宫颈癌SiHa 细胞设置为GABPB1-IT1 组、Vector 组。将没有转染的细胞设置为Control 组。Control 组、Vector 组、GABPB1-IT1 组细胞培养24 h 以后，根据“1.2”项中qRT-PCR方法检测GABPB1-IT1表达水平。

1.4 CCK-8方法检测细胞增殖

宫颈癌SiHa 细胞按照每个孔中150 μL 细胞培养液、3 000个细胞种植到96孔板中，然后按照Control、Vector、GABPB1-IT1 组分组方法处理，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h以后，将培养板取出，分别加入10 μL 的CCK-8，继续反应2 h。酶标仪测定每个样品孔450 nm 的OD 值。计算细胞存活率（对照组细胞存活率为100%）。

1.5 Transwell小室检测细胞迁移和侵袭

细胞侵袭实验前需要将小室包被，步骤如下：将基质胶和DMEM按照1∶7的比例混合，然后吸取60 μL 添加到Transwell 小室中，放在37 ℃孵育，观察基质胶凝固以后备用。将Control 组、Vector 组、GABPB1-IT1 组以不含血清的细胞培养液悬浮，吸取200 μL的细胞溶液添加到小室的上室中，在下室中添加500 μL 的含血清细胞培养液。将小室放在37 ℃培养24 h 后，将没有穿膜的细胞擦掉，以PBS洗涤。无水甲醛固定，0.1%的结晶紫染色，在显微镜下观察细胞迁移和侵袭数目。

1.6 Western blotting 检测MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达

收集培养24 h 以后的Control 组、Vector 组、GABPB1-IT1 组细胞，添加RIPA 溶液，放在冰上裂解20 min，用细胞刮将细胞刮下，冰浴，超声5次，每次1 s，间隔2 s。4 ℃，12 000 g 离心10 min，吸取上清溶液转移到新的EP 管内，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）方法测定样品的浓度。分别制备10%的分离胶和5%的浓缩胶。蛋白在添加到上样孔以前需要和等体积的2×上样缓冲液煮沸5 min。设置80 V 的电压电泳，观察溴酚蓝快要进入分离胶时，将电压设置为120 V 继续电泳。电泳结束后，将硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜根据凝胶的大小裁剪。利用三明治法进行转膜，转膜电压为90 V，转膜90 min 以后，将NC 膜放在5%脱脂奶粉溶液中，低速室温摇床孵育2 h。将一抗和二抗分别用TBST 稀释，一抗按照1∶1 000 稀释，二抗按照1∶2 000稀释。NC膜置于一抗中，室温结合2 h，NC膜置于二抗中，室温结合2 h。增强型化学发光（enhance chemiluminescence，ECL）显色。Biod-Rad 显影。分析条带的灰度值，内参为GAPDH，对蛋白进行半定量分析。

1.7 GABPB1-IT1 靶向关系预测及荧光素酶系统鉴定靶向关系

利用starbase 数据库对GABPB1-IT1 的靶基因进行分析，通过荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将野生型（wild type，WT）和突变型（mutant type，MUT）分别同miR-501 mimics、mimics control 共转染到宫颈癌SiHa 细胞中，培养24 h 以后，荧光素酶活性测定试剂盒检测荧光素酶活性变化。WT 和MUT 分别是含有GABPB1-IT1 结合位点的野生型荧光素酶报告载体和含有突变之后的GABPB1-IT1结合位点的突变型荧光素酶报告载体。收集培养24 h以后的Control组、Vector组、GABPB1-IT1组细胞，以qRT-PCR 方法检测miR-501 表达水平，U6 为内参，按照miRNA第一链cDNA合成试剂盒进行反转录，反转录体系包含：110 μL 的2×miRNA L-RT Solution mix、1 μL 的STem-loop primer、200ng 的RNA、5 μL 的miRNA L-RT Enzyme mix，加RNasefree water 至20 μL，放在16 ℃30 min，37 ℃30 min，85 ℃5 min。利用SYBR Premix Ex Taq miRNA kit进行实时定量PCR，PCR 体系包含：1 μL 的forward以及reverse primer、12.5 μL 的SYBR Premix Ex Taq II、1 μL 的cDNA，加ddH2O 至20 μL，在95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，55 ℃30 s，共40 个循环。引物序列为：miR-501 上游（5’-3’）AATGCACCCGGGCAAGGATTCT，下游（3’-5’）AGAATCCTTGCCCGGGTGCATT；U6 上游（5’-3’）GCTTCGGCAGCACATATACT，下游（3’-5’）GTGCAGGGTCCGAGGTATTC。

1.8 miR-501的逆转作用

宫颈癌SiHa 细胞中分别转染pcDNA-GABPB1-IT1、miR-501 mimics 和pcDNA-GABPB1-IT1、mimics control，记 为GABPB1-IT1+miR-501 组 和GABPB1-IT1+miR-NC 组。以GABPB1-IT1+miRNC 组为参照，按照“1.2”项中qRT-PCR 方法、“1.4”项中CCK-8、“1.5”项中Transwell 小室、“1.6”项中Western blot 方法分别检测miR-501 表达水平、增殖、迁移侵袭和MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达水平。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件分析进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GABPB1-IT1在宫颈癌细胞中相对低表达

宫颈癌HeLa、Caski、SiHa 细胞中GABPB1-IT1表达水平低于正常宫颈上皮Ect1/E6E7 细胞（P＜0.05）。宫颈癌HeLa、Caski 细胞中GABPB1-IT1 表达水平高于宫颈癌SiHa 细胞（P＜0.05），见表1。GABPB1-IT1在宫颈癌细胞中相对低表达。选择表达水平最低的宫颈癌SiHa细胞作后续实验。

表1 宫颈癌HeLa、Caski、SiHa 细胞和正常宫颈上皮Ect1/E6E7细胞中GABPB1-IT1表达水平

表1 宫颈癌HeLa、Caski、SiHa 细胞和正常宫颈上皮Ect1/E6E7细胞中GABPB1-IT1表达水平

与Ect1/E6E7比较，*P＜0.05；与SiHa比较，#P＜0.05。

2.2 pcDNA-GABPB1-IT1上调宫颈癌SiHa细胞中GABPB1-IT1表达水平

与Control组、Vector组比较，GABPB1-IT1组宫颈癌SiHa 细胞中GABPB1-IT1 表达水平升高（P＜0.05），见表2。pcDNA-GABPB1-IT1上调宫颈癌Si-Ha细胞中GABPB1-IT1表达水平。

表2 pcDNA-GABPB1-IT1 转染以后宫颈癌SiHa 细胞中GABPB1-IT1表达水平

表2 pcDNA-GABPB1-IT1 转染以后宫颈癌SiHa 细胞中GABPB1-IT1表达水平

与Control组和Vector组比较，*P＜0.05。

2.3 上调GABPB1-IT1对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与Control、Vector 组比较，GABPB1-IT1 组宫颈癌SiHa 细胞存活率降低，细胞迁移和侵袭数目减少，细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白表达水平升高（P＜0.05），见图1，表3。上调GABPB1-IT1降低宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭能力。

表3 上调GABPB1-IT1对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭的影响

表3 上调GABPB1-IT1对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与Control组和Vector组比较，*P＜0.05。

图1 上调GABPB1-IT1对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.4 GABPB1-IT1靶向下调miR-501表达

生物信息学软件发现，GABPB1-IT1 和miR-501存在互补结合位点，并且miR-501 mimics和WT共转染以后的细胞荧光素酶活性降低；与Control组、Vector组比较，GABPB1-IT1组宫颈癌SiHa细胞中miR-501表达水平降低（P＜0.05），见图2，表4，表5。

表4 荧光素酶活性

表4 荧光素酶活性

与mimics control组比较，*P＜0.05。

表5 上调GABPB1-IT1后宫颈癌SiHa细胞中miR-501水平

表5 上调GABPB1-IT1后宫颈癌SiHa细胞中miR-501水平

与Control组和Vector组比较，*P＜0.05。

图2 GABPB1-IT1和miR-501靶向结合位点

2.5 miR-501 逆转GABPB1-IT1 对宫颈癌SiHa 细胞增殖、迁移和侵袭作用

与GABPB1-IT1+miR-NC 组比较，GABPB1-IT1+miR-501组宫颈癌SiHa细胞中miR-501水平升高，细胞存活率、细胞迁移数目和侵袭数目均升高，细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin 蛋白表达水平升高，E-cadherin 蛋白表达水平降低（P＜0.05），见图3，表6。miR-501 逆转GABPB1-IT1 对宫颈癌Si-Ha细胞增殖、迁移和侵袭作用。

图3 miR-501逆转GABPB1-IT1对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭作用

表6 miR-501逆转GABPB1-IT1对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭作用

表6 miR-501逆转GABPB1-IT1对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭作用

与GABPB1-IT1+miR-NC组比较，*P＜0.05。

3 讨论

lncRNA 是不具备编码蛋白质作用的转录本，也有一小部分的lncRNA被证实可以编码一些小的多肽，并且通过这些小多肽发挥功能[11]。相对于编码蛋白质基因，lncRNA 在组织中的表达丰度较低，并且有细胞和组织特异性，lncRNA 能够作为骨架、诱饵、信号、向导，通过转录以及转录后水平、表观遗传学水平发挥作用[12]。lncRNA参与人类疾病，其中肿瘤是人们研究的热点之一。lncRNA 在肿瘤中的表达水平发生改变，lncRNA 通过影响肿瘤细胞的生长、迁移等过程参与调控肿瘤的转移和进展[13]。在非小细胞肺癌中发现，GABPB1-IT1 表达下调促进肿瘤进展，GABPB1-IT1 可能是一个肿瘤抑制因子[8]。本研究结果显示，GABPB1-IT1在宫颈癌细胞中表达下调，推测GABPB1-IT1 在宫颈癌中发挥抑制作用，进一步通过细胞增殖实验发现，上调GABPB1-IT1 后的宫颈癌细胞存活率降低，证明GABPB1-IT1 具有抑制宫颈癌细胞增殖的作用，提示GABPB1-IT1 可能是一个宫颈癌抑制因子，这与以前的研究结果相符合，说明GABPB1-IT1 在肿瘤中可能发挥类似抑癌基因的作用。

很多肿瘤患者死亡的重要原因是肿瘤发生远端转移，肿瘤细胞通过向周围组织中迁移和侵袭形成新的病发灶，加重肿瘤进展[14]。肿瘤转移过程中，肿瘤细胞能够产生大量的细胞外基质降解酶，这些蛋白酶能够分解细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和侵袭提供条件[15]。细胞外基质降解酶种类繁多，基质金属蛋白酶是常见的细胞外基质降解酶，其含有多个蛋白成员，其中MMP-2 和MMP-9 是目前发现的与肿瘤转移关系十分密切的细胞外基质降解酶[16]。MMP-2和MMP-9在肿瘤中过度表达，MMP-2 和MMP-9 表达增多被认为是肿瘤细胞转移能力升高的标志[17]。很多研究报道表明，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肿瘤转移的早期标志事件，EMT水平升高后肿瘤转移能力也增加[18]。EMT 被定义为上皮细胞特征消失而逐渐表现出间质细胞特征的过程，在人体生理活动如器官发育、组织修复等过程中发挥重要作用，EMT还参与心肌纤维化、肾组织纤维化等病理过程[19-20]。N-cadherin是一个间质细胞标志蛋白，其在肿瘤中高表达[21]。E-cadherin 是一个上皮细胞标志蛋白，其在肿瘤中表达下调[22]。经Transwell小室实验发现，上调GABPB1-IT1 后的宫颈癌细胞迁移和侵袭数目减少，推测GABPB1-IT1 具有抗宫颈癌细胞迁移和侵袭作用；经Western blotting检测定表明，上调GABPB1-IT1后的细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低，提示GABPB1-IT1 减少了宫颈癌细胞合成细胞外基质降解酶，同时本研究还发现，上调GABPB1-IT1 后的宫颈癌细胞中E-cadherin 蛋白表达水平升高，N-cadherin蛋白表达水平降低，上调GABPB1-IT1降低了宫颈癌细胞EMT水平，提示上调GABPB1-IT1可能通过抑制细胞EMT、减少细胞合成细胞外基质降解酶发挥抗肿瘤迁移和侵袭作用。

目前对lncRNA 发挥作用的机制还未完全阐明，已知其可以通过与miRNA 结合发挥生物学功能。lncRNA 以碱基互补的方式与miRNA 结合，最终影响miRNA的表达，参与不同的病理以及生理过程，一个lncRNA 可同时调控多个miRNA，同一个miRNA 可以同时受到多个lncRNA 的调控作用，细胞中各个基因也正是通过这种复杂的网络最终影响细胞功能发挥[23]。本研究结果表明，GABPB1-IT1和miR-501存在互补结合位点，而且上调GABPB1-IT1后的宫颈癌细胞中miR-501表达水平下降，推测GABPB1-IT1 的作用机制可能与miR-501 有关。miR-501 是一个与人类肿瘤有关多功能小分子RNA，在肝癌、非小细胞肺癌、宫颈癌等肿瘤中表达上调，miR-501 能够促进肿瘤细胞的生长和迁移[10,24-25]。本研究通过逆转实验验证GABPB1-IT1的作用机制是否与miR-501 有关，结果表明，miR-501 mimics 提高了上调GABPB1-IT1后的宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能能力，说明miR-501具有逆转GABPB1-IT1 对宫颈癌细胞影响的作用，GABPB1-IT1通过miR-501参与宫颈癌进展。

总而言之，GABPB1-IT1 在宫颈癌中可能发挥抑制作用，上调GABPB1-IT1 表达降低宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，机制与靶向下调miR-501 有关。本研究结果为分子靶向治疗宫颈癌提供了参考资料，为研究GABPB1-IT1 在宫颈癌中的作用机制奠定了基础，以后可进一步探讨GABPB1-IT1 靶向miR-501的下游机制。