郭 逸，华 川，喻秀兰，裴 迅，李 扬

（湖北省中医院内分泌科，武汉 430070）

甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率呈增长趋势[1]。多数甲状腺癌患者经治疗后预后良好，但仍有部分患者恶性程度高，易复发，预后不佳[2]。因此，探究甲状腺癌的发生发展机制并寻找有效的治疗靶点和治疗药物尤为重要。姜黄素是从姜黄、莪术、郁金等植物中提取得到的一种天然多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效[3]。已有报道称，姜黄素可通过诱导甲状腺癌细胞内质网应激抑制其生长[4]；姜黄素可增加甲状腺癌细胞中甲状腺球蛋白和钠碘转运体蛋白等再分化标志物的表达，并诱导细胞周期G2/M期阻滞、凋亡和NF-κB 活性降低，具有抗甲状腺癌的作用[5]。miR-152是一种微小RNA（miRNA），在非小细胞肺癌[6]、肝癌[7]和宫颈癌[8]等肿瘤中表达降低，上调其表达可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移等恶性行为，是肿瘤治疗的潜在分子靶点。本研究以甲状腺癌细胞TPC-1 为研究对象，旨在探究姜黄素可否通过调控miR-152的表达影响TPC-1细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

甲状腺癌细胞系TPC-1（中国科学院上海细胞库）；姜黄素，纯度＞98%（美国Sigma公司）；胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司）；RPMI 1640 培养基、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；LipofectamineTM2000 试剂盒和Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司）；miR-152 抑制剂（anti-miR-152）、抑制剂阴性序列（anti-miR-NC）和PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、活化的半胱天冬酶-3（Cleaved-caspases-3）、B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP9 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；逆转录试剂盒和PCR试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 在超净工作台内复苏TPC-1细胞，加含10%FBS的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。每2～3 d 更换一次培养基，待细胞生长密度至80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。将对数期TPC-1 细胞以1.0×105个/孔TPC-1 细胞接种于6孔板中，培养12 h后，弃培养基。取灭菌EP管，加250 μL Opti-MEM培养液和6.0 μL Lipofectamine 2000试剂，混合均匀，室温条件下孵育5 min。另取灭菌EP管，加250 μL Opti-MEM培养液和终浓度为100 nmol/L 的anti-miR-152 或anti-miR-NC，混合均匀，在室温条件下孵育5 min。将两管内两种液体混合，在室温条件下孵育15 min后，取100 μL混合液，缓慢加至6 孔板中。轻轻前后摇晃培养板，混合均匀后，置于培养箱中孵育6 h。弃培养基，换新鲜培养基，再培养24 h，实时荧光定量PCR（qPCR）检测细胞中miR-152 表达验证转染效果，并收集细胞备用。

1.2.2 细胞分组处理 未转染的细胞分为对照组（NC 组）、低剂量组和高剂量组，其中NC 组细胞常规培养24 h，低剂量组和高剂量组细胞分别用含25 μmol/L、50 μmol/L[5]姜黄素的培养基培养24 h。转染anti-miR-152、anti-miR-NC 的细胞均用常规培养基培养24 h，分别记为anti-miR-152 组、anti-miRNC组。转染anti-miR-152、anti-miR-NC的细胞均用含50 μmol/L姜黄素的培养基培养24 h，分别记为高剂量+anti-miR-152组、高剂量+anti-miR-NC组。

1.2.3 CCK-8 法检测细胞增殖 细胞以0.5×104个/孔接种于96 孔板中，按1.2.2 分组处理，培养结束后，加10 μL/孔CCK-8 试剂。孵育2 h 后，酶标仪450 nm测光密度（OD）值。

1.2.4 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 细胞以2.5×104个/孔接种于24 孔板中，按“1.2.2”项分组处理，培养结束后，收集细胞，并调整为密度5.0×104个/mL 的细胞悬液。迁移实验：Transwell 上室加100 μL 细胞悬液，下室加入500 μL 培养基。培养24 h后，4%多聚甲醛固定25 min，0.4%结晶紫染色15 min。显微镜观察，随机取5个视野，对迁移细胞计数。侵袭实验：先将Matrigel 基质胶铺于Transwell上室，自然晾干后，加100 μL细胞悬液，后续操作同迁移实验。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞以2.5×104个/孔接种于24孔板中，按“1.2.2”项分组处理，培养结束后，收集细胞，参照Annexin V-FITC/PI 试剂盒说明书操作步骤，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 Western blotting 法检测蛋白表达 细胞以2.5×104个/孔接种于24 孔板中，按“1.2.2”项分组处理，培养结束后，收集细胞，使用RIPA试剂提取细胞中总蛋白，并用BCA 法对蛋白溶液进行定量，然后行SDS-PAGE。电泳后，湿转至PVDF 膜，并于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h。分别置于CyclinD1（1∶500）、p21（1∶500）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、MMP2（1∶500）、MMP9（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育液中，4 ℃冰箱孵育过夜。再置于山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育液中，37 ℃孵育1 h。最后加显影液避光显影，曝光拍照。

1.2.7 qPCR检测miR-152表达 细胞以2.5×104个/孔接种于24 孔板中，按“1.2.2”项分组处理，培养结束后，收集细胞，使用Trizol 试剂提取细胞中总RNA，逆转录为cDNA 后行PCR 扩增。扩增程序：95 ℃5 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35个循环。引物序列：miR-152 上游5’-TTTGGCTCTGACCATTCTGT-3’，下游5’-GTCCTCACCTGAGGGACCCC-3’；U6 上游5’-GTCCGAAGTGCGCGGAGAGATCG-3’，下 游5’-TGAGGAGCCCTCGCTTATATGCTC-3’。采用2－△△Ct法计算miR-152相对于内参U6的表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对TPC-1细胞增殖的影响

与NC 组比较，低剂量组和高剂量组TPC-1 细胞OD值、CyclinD1蛋白表达降低（P＜0.05），p21蛋白表达升高（P＜0.05），见图1、表1。

图1 姜黄素对TPC-1细胞中CyclinD1、p21蛋白表达的影响

表1 姜黄素对TPC-1细胞增殖的影响 ，n=9

表1 姜黄素对TPC-1细胞增殖的影响 ，n=9

与NC组比较，*P＜0.05。

2.2 姜黄素对TPC-1细胞凋亡的影响

与NC 组比较，低剂量组和高剂量组TPC-1 细胞凋亡率及Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白表达升高（P＜0.05），见图2、图3、表2。

图2 姜黄素对TPC-1细胞凋亡的影响

图3 姜黄素对TPC-1 细胞中Bax、Cleaved-caspase-3 蛋白表达的影响

表2 姜黄素对TPC-1细胞凋亡及Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响 ，n=9

表2 姜黄素对TPC-1细胞凋亡及Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响 ，n=9

与NC组比较，*P＜0.05。

2.3 姜黄素对TPC-1细胞迁移和侵袭的影响

与NC 组比较，低剂量组和高剂量组TPC-1 细胞迁移和侵袭数及MMP2、MMP9 蛋白表达降低（P＜0.05），见图4、图5、表3。

图4 姜黄素对TPC-1细胞迁移和侵袭的影响

图5 姜黄素对TPC-1细胞MMP2、MMP9蛋白的影响

表3 姜黄素对TPC-1细胞迁移和侵袭的影响 ，n=9

表3 姜黄素对TPC-1细胞迁移和侵袭的影响 ，n=9

与NC组比较，*P＜0.05。

2.4 姜黄素对TPC-1细胞中miR-152表达的影响

与NC组比较，高剂量组TPC-1细胞中miR-152表达升高（P＜0.05），见表4。

表4 姜黄素对TPC-1细胞中miR-152表达的影响 ，n=9

表4 姜黄素对TPC-1细胞中miR-152表达的影响 ，n=9

与NC组比较，*P＜0.05。

2.5 下调miR-152 降低姜黄素对TPC-1 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-152 组TPC-1细胞中miR-152表达降低（P＜0.05），说明下调miR-152表达的TPC-1细胞构建成功；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-152 组TPC-1 细胞OD 值、迁移和侵袭数及CyclinD1、MMP2 和MMP9 的蛋白表达升高（P＜0.05），凋亡率及p21、Cleaved-caspase-3 和Bax的蛋白表达降低（P＜0.05）。与高剂量+anti-miRNC 组比较，高剂量+anti-miR-152 组TPC-1 细胞中miR-152 表达降低（P＜0.05），TPC-1 细胞OD 值、迁移和侵袭数及CyclinD1、MMP2 和MMP9 的蛋白表达升高（P＜0.05），凋亡率及p21、Cleaved-caspase-3和Bax 的蛋白表达降低（P＜0.05），见图6、图7、表5。

表5 下调miR-152降低姜黄素对TPC-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 ，n=9

表5 下调miR-152降低姜黄素对TPC-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 ，n=9

与anti-miR-NC组比较，*P＜0.05；与高剂量+anti-miR-NC组比较，#P＜0.05。

图6 下调miR-152降低姜黄素对TPC-1细胞中增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

图7 下调miR-152降低姜黄素对TPC-1细胞凋亡的影响

图8 下调miR-152降低姜黄素对TPC-1细胞迁移和侵袭的影响

3 讨论

姜黄素是天然的多酚类化合物，具有抗肿瘤功能。研究显示，姜黄素可通过抑制β-catenin/TCF4信号途径降低胃癌细胞MGC-803的增殖、侵袭和间质转化能力，并诱导凋亡[9]；姜黄素可通过下调p-Akt蛋白，上调PTEN蛋白表达减弱神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[10]；姜黄素可抑制肺癌细胞A549的上皮间质转化过程降低其迁移和侵袭[11]；姜黄素通过下调Smad2/3 信号通路抑制TGF-β1 诱导的上皮－间质转化（EMT）降低了甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力[12]。本研究显示，25 μmol/L、50 μmol/L的姜黄素可有效降低甲状腺癌细胞TPC-1 的增殖、迁移和侵袭能力，同时诱导TPC-1 细胞凋亡，与孙巍[13]和孙丽静等[14]报道的结果一致，说明姜黄素具有一定抗甲状腺癌的作用。

细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等受多种基因的调控。CyclinD1参与调控细胞周期，其表达增加加速细胞周期进程，促进细胞增殖[15]。p21 是目前公认的肿瘤抑制因子，其表达增加降低肿瘤细胞的增殖能力。Caspase 级联反应是细胞凋亡的重要执行过程，切割激活caspase-3酶原后，活化的caspase-3发挥调控作用，引起细胞凋亡[16]。Bax是促凋亡蛋白，表达增加可促进细胞凋亡。MMP2和MMP9是研究最为广泛的基质金属蛋白酶，其可通过降解细胞外基质促进肿瘤细胞迁移和侵袭[17]。本研究显示，姜黄素抑制甲状腺癌细胞TPC-1 中CyclinD1、MMP2 和MMP9 的蛋白表达，而促进p21、Cleavedcaspase-3 和Bax 的蛋白表达(均P＜0.05)，进一步说明姜黄素可抑制TPC-1细胞增殖、迁移和侵袭，且促进TPC-1细胞凋亡。

miR-152是miR-148/152家族成员之一，参与调控细胞的增殖、凋亡等生命活动，在多种肿瘤的发展进程中起重要作用。研究显示，miR-152 在前列腺癌患者血清中表达降低，其低表达与患者临床分期、是否存在骨转移及病理分期密切相关[18]；miR-152 可通过抑制AKT-ERK 信号通路来减弱结肠癌细胞增殖和迁移[19]；在乳腺癌组织中表达下调，上调其表达可靶向抑制ROCK1的表达降低乳腺癌的增殖、迁移和侵袭，miR-152/ROCK1 途径可能是乳腺癌治疗的靶标[20]。本研究显示，下调miR-152 表达促进了甲状腺癌细胞TPC-1 的增殖、迁移和侵袭能力，且抑制了TPC-1 细胞凋亡(均P＜0.05)，与Kang等[21]报道的过表达miR-152可抑制TPC-1细胞增殖和集落形成的结果一致，提示miR-152 抑甲状腺癌发挥抑癌基因作用，可作为甲状腺癌治疗的分子靶点。本研究还显示，姜黄素可促进TPC-1 细胞中miR-152 的表达，而下调miR-152 表达降低了姜黄素对TPC-1 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及凋亡促进作用(均P＜0.05)，提示姜黄素可能通过上调miR-152的表达来抑制甲状腺癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，姜黄素可有效抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且促进细胞凋亡，其作用机制可能与上调细胞中miR-152 的表达有关，具有开发为治疗甲状腺癌药物的潜在价值。