林 楚，刘凯丽，王 潇，蒙丽恒，秦映芬

（广西医科大学第一临床医学院，南宁 530021）

原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是临床上比较多见的一种肿瘤性疾病，每年因此疾病而死亡的人数约占全世界总死亡数的一半以上[1]。根据目前的研究可知，2 型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）与肝癌发生之间具有明确的相关性，T2DM患者患肝癌的风险可以增加大约2.5倍[2-4]。作为糖尿病的早期表现，血糖水平的升高可能直接调节肿瘤相关信号通路，特别是满足癌细胞对高糖的需求[5-6]，提示高糖可促进肝脏肿瘤形成的能力。转移是恶性肿瘤导致死亡的主要因素。肝癌发生转移后，5 年存活率不足15%[7]。大量证据显示，肝细胞由恶性发展到肝癌，以及癌细胞脱落并获得迁移和侵袭能力的所有过程中均可发生上皮—间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）[8-11]。EMT是肝癌发展及侵袭转移的原始动力。此外，大量的研究发现，在高糖环境下，不论是正常细胞还是癌细胞都可能发生EMT 的改变[12-13]。然而，在高糖环境下肝癌细胞发生EMT的机制尚不清楚。

转录因子E2F1（E2F transcription factor 1，E2F1）作为新陈代谢的调节器可参与维持机体代谢与稳态的所有组织的发育及分化过程[14]。近年来，E2F 家族的转录因子对肿瘤的影响也逐渐被报道。研究报道[15]，高糖可以刺激E2F1 的表达，并通过促进E2F1/RRBP1信号通路的激活可加速肝癌细胞的增殖和转移。E2F1 调控着肝癌的恶性发展过程[16-18]，但是关于高糖条件下E2F1 如何促进肝癌发展尚不可知，E2F1 能否对肝癌早期转移标志的EMT产生影响，更是未见相关报道。本研究旨在探讨高糖条件下E2F1与Huh-7肝癌细胞EMT的相关关系，并初步探索可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人Huh-7肝癌细胞购于中科院上海细胞库。人Huh-7 肝癌细胞培养在包含有DMEM 完全培养基3～5 mL 的培养瓶中，用含胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM 培养Huh-7 细胞。放于37 ℃恒温5%CO2的温箱中。

1.2 细胞转染

选用的siRNA 靶序列：GAGACCTCTTCGACTGTGA。为了获得E2F1 沉默的Huh-7 细胞，根据制造商的说明书采用riboFECT™CP Reagent 的转染试剂对Huh-7细胞进行转染。

1.3 细胞活力测定

采用CCK-8试验测定细胞活力。将Huh-7细胞镀在96孔板中。转染后，细胞培养为分别为0 h、24 h、48 h 和72 h，然后在每个孔中加入10 μL CCK8（10 mg/mL），孵育2 h，在450 nm的测试波长下检测吸光度。

1.4 蛋白质印迹法（Western blotting）

细胞在添加PMSF 的RIPA 缓冲液中裂解，用SDS-PAGE分离蛋白裂解液并转移到PVDF膜。在此之后，在5%脱脂牛奶缓冲液中室温孵育2 h，4 ℃摇床孵育一晚。用TBST缓冲液洗涤3次，PVDF膜与二抗孵育放在室温下摇床1～2 h即可。然后采用ECL试剂盒对目的条带进行曝光显影，在Image J软件中对条带的灰度值进行计算，目的蛋白/内参灰度值的比值便是相应的相对蛋白表达量。

1.5 逆转录定量PCR（RT-PCR）

采用Trizol（America Invitrogen）制备总RNA。采用RNA 逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。实时PCR 引物序列，见表1。应用qPCR 扩增仪（Bio-Rad CFX connect Real-Time System，Bio-Rad，Hercules，CA）进行定量PCR。以GAPDH用作内参。

表1 各引物序及其序列

1.6 侵袭和迁移试验

采用划痕实验和Transwell 侵袭实验测定细胞的迁移和侵袭能力。对于侵袭试验，用移液枪混匀DMEM 培养基与Corning Matrigel 胶后吸取100 μL加入到Transwell小室的上室。对下室给予10%FBS的培养基600 μL。培养24 h 后用蘸有PBS 的湿棉签温柔地将上室中的细胞擦拭干净，将小室底面先后放入甲醇及0.1%的结晶紫中各半小时，最后在显微镜下观察侵袭的细胞数并保存照片留档。对于划痕试验，细胞被生长在6 孔板中汇合，在0 h 受伤，并在0 h和48 h的时间点拍照。用移液枪100 μL规格的枪头划伤细胞。然后用PBS液清洗，去除游离漂浮的细胞和碎片，在不同糖浓度的DMEM培养基中再培养24 h。最后在Imag J软件中计算出各组的划痕愈合率。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件进行数据分析。计量资料以平均值±标准差（）表示，组间比较采用t检验或者方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖促进了Huh-7细胞增殖、迁移和侵袭

CCK-8 试验结果显示，在0 h 时两组细胞的吸光度值差异无统计学意义（P＞0.05）；随着时间的延长，高糖组细胞的吸光度值增长较对照组明显加快（P＜0.05）（图1）。Transwell侵袭试验结果表明，高糖组细胞的侵袭数目明显多于对照组（图2）；划痕试验显示，高糖组细胞的划痕愈合率较对照组增加（P＜0.05）（图3）。

图1 两组细胞在不同时间点的吸光度值

图2 不同浓度葡萄糖对Huh-7细胞侵袭的影响

图3 不同葡萄糖浓度对Huh-7细胞迁移能力的影响

2.2 高糖条件下加速了Huh-7细胞的EMT过程

与对照组相比，高糖组EMT 相关标志物（βcatenin、Vimentin、α-SMA）表达升高（P＜0.05）（图4）。

图4 不同葡萄糖浓度下EMT的表达情况

2.3 高糖下E2F1表达情况

对照组和高糖组分别培养Huh-7 细胞48 h。Western blotting 和RT-PCR 结果显示，高糖组E2F1相对蛋白表达量明显高于对照组（P＜0.05）（图5）；高糖组E2F1 mRNA水平高于对照组（P＜0.05）。

图5 不同葡萄糖浓度下E2F1的表达

2.4 高糖通过上调E2F1促进Huh-7细胞EMT和侵袭、迁移

在高糖环境下，培养沉默E2F1 的Huh-7 细胞为HG+SIE 组，未沉默E2F1 的Huh-7 细胞为HG+NC 组。分别对两组细胞进行Transwell 侵袭、迁移试验，结果表明，HG+SIE组细胞的侵袭数和迁移数均少于HG+NC 组细胞的侵袭数（P＜0.05）（图6、图7）。用Western blotting 和RT-PCR 实验方法检测细胞中EMT 相关标记物（E-cadherin、Vimentin、α-SMA）的表达，结果表明，HG+SIE组细胞中EMT相关标志物的表达较HG+NC组下降（P＜0.05）（图8）。

图6 E2F1对Huh-7细胞侵袭性的影响

图7 E2F1对Huh-7细胞迁移的影响

图8 E2F1对EMT表达的影响

3 讨论

糖尿病的发病率越来越高，预计到2045年将有近7 亿人受到糖尿病的影响。而HCC 将成为全球第6 大最常见诊断癌症和第4 大癌症相关死亡原因[19]。超过一半的新诊断癌症病例和死亡病例发生在中国[1,20-22]。因此，中国作为糖尿病及肝癌的高发区，糖尿病与肝癌的关系理应给予更多的关注。本研究发现，高糖可促进Huh-7细胞的增殖，并且通过Transwell 侵袭试验和划痕试验也提示高糖可促进肝癌细胞的侵袭和转移能力，与既往的研究结果相似。

E2F1可以参与对癌细胞的代谢重组，与肿瘤进展、转移和预后密切相关，为重要的促癌因子[18]。有文献报道，在小细胞肺癌的进程中，E2F1 参与调控其中的侵袭和转移过程[23]；在对肾细胞癌的研究中发现，E2F1 表达上调可加速细胞周期中G1/S 期的转变，使癌细胞的增值、迁移和侵袭作用增强[24]；在通过对E2F1 转基因小鼠的研究中也观察到其肝脏中肿瘤的形成[25]。虽然E2F1 在肝癌中的作用已被公认，但E2F1调控肝癌的机制却是复杂多样的。研究表明，E2F1 可以通过Cyclin E1/E2、Pin-1、SKP2、EZH2/CCRK、miR429/RBBP4 等作用促进肝癌细胞的增殖及生长[9,26]。此外，过表达的E2F1 还可通过调节H19使肝癌细胞HepG2的侵袭能力增加[27]。本研究结果显示，Huh-7肝癌细胞在高糖环境中E2F1的表达量相对于正常糖浓度培养的细胞中表达上调，再次证实了高糖对E2F1的促进作用。

EMT 在人体中主要参与胚胎形成、器官发育、组织愈合，同时也参与肿瘤的发生和转移，通过改变细胞间相互作用和细胞与基质间的相互作用，促进肿瘤细胞侵袭和运动[28]。EMT 通常伴随着间充质细胞特有的蛋白质表达（比如β-catenin，Vimentin、α-SMA）和上皮标志物的丢失（比如E-cadherin）[29]。如前所述，本研究结果发现高糖促进了Huh-7 细胞侵袭和迁移能力，并且证实了高糖对E2F1 的促进作用。但E2F1 和EMT 的关系尚不清楚。本研究中将Huh-7细胞培养于不同糖浓度的培养基中，通过Transwell 侵袭试验结果表明，高糖环境仅可以加强Huh-7 细胞的侵袭迁移能力，而且EMT 相关指标（E-cadherin、Vimentin、α-SMA）的表达水平均增加。虽然在经典的EMT过程中，通常被定义为E-cadherin等指标的丢失和Vimentin等指标的上调，本研究中高表达的E-cadherin 似乎与既往典型EMT标志物的改变相矛盾，但仍有大量的研究结果与此结论并不一致甚至相反。在对乳腺癌和唾液腺癌的分析中显示，E-cadherin 的表达与肿瘤的侵袭性之间并不存在完全的相关关系[30-31]。虽然在肿瘤巢边缘和多细胞簇浸润前沿的癌细胞中，Ecadherin 是呈现较低表达的状态，但在实体肿瘤巢中心的癌细胞中却几乎是正常表达E-cadherin[32]。甚至一些晚期癌症在表达细胞间质性改变的同时，也保留E-cadherin高表达水平以及高度分化的上皮细胞的特征[30]。从最近Karaosmanoğlu 等[33]的研究中也发现，Huh-7肝癌细胞中，Slug介导细胞在发生EMT 过程时呈现出E-cadherin 表达的升高，其分子的改变也和经典的EMT并不相同。此外，有证据表明，EMT 可以分为部分性EMT[34]和完全性EMT[35]。当细胞经历完全性EMT 时，以E-cadherin 为代表的上皮性“开关”将会完全丧失；然而，当细胞发生部分性EMT 时，并非所有的上皮特征（如E-cadherin）完全被间质特征的标记物（如Vimentin）所取代，而是出现的一个同时表达的共存现象。因此，当细胞发生部分性EMT时，可在上皮特征不完全丧失或间质特征不完全获得的情况下便启动转移[37]。有研究发现，肝细胞生长因子诱导的犬肾MDCK细胞在发生部分性EMT 过程中，E-cadherin 的表达也可呈现瞬时性上调，说明E-cadherin 的上调是可参与至EMT的发生[41]。为探讨在高糖条件下Huh-7肝癌细胞EMT 的发生是否由E2F1 介导，本研究采用沉默Huh-7肝癌细胞中E2F1的表达，以便进一步探讨二者之间的关系。研究结果显示，在高糖环境中，将细胞中E2F1 沉默后，与对照组相比，Huh-7 肝癌细胞的侵袭和迁移能力都随之减弱，同时EMT相关标志物Vimentin、α-SMA 的表达也出现降低，综合本研究结果得知在高糖的条件下细胞中E2F1 可介导EMT 的发生，但其中的分子机制还有待进一步研究。

本研究仍然存在一些不足之处。首先，本研究结果均只在细胞层面上进行验证，且也仅限于Huh-7肝癌细胞。其次，与众多研究相符，本研究显示高糖时细胞在功能上发生EMT的改变，但是在分子层面上细胞发生EMT 时E-cadherin 的结果却与多数研究不尽相同，后续可以在此方面进行更深入的探索。

综上所述，本研究证实高糖可通过上调E2F1，促进EMT增强Huh-7细胞的增殖和转移，为后续肝癌及糖代谢相关关系的研究提供了可靠理论基础。