宋 蕊，张鑫悦，周红辉，谢潇潇，卢彦平

解放军总医院第一医学中心，北京 100853

拉森综合征(Larsen syndrome OMIM 150250)为一种罕见的先天性骨骼畸形病，主要特点为双侧肘关节脱位、髋部脱位、膝关节脱位、外翻足以及铲状指(尤以大拇指为重)，典型的面部表现为面中部发育不全、鼻梁凹陷、眼距过远、前额突出[1-3]。拉森综合征的病因为FLNB 基因杂合突变，并呈常染色体显性遗传[4]。该基因的杂合错义突变最早于2004 年在4 种骨骼畸形疾病中被报道，其中包括一个常染色体显性遗传的拉森综合征家系[5-6]。本文报道1 例于孕25+2周引产胎儿，娩后见双侧肘关节、膝关节挛缩固定，马蹄足畸形，鼻梁凹陷、面中部扁平等表型。经Next-generation sequencing panel 家系 测序 确定引产儿为FLNB c.565T＞C(p.189,W＞R)杂合突变，经一代测序验证双亲及第二胎基因型为野生型，无明显临床表型。

资料与方法

1病例资料 本研究经解放军总医院第一医学中心伦理委员会批准，并获得胎儿父母的知情同意，伦理批号为2018TM-11。2015 年6 月解放军总医院第一医学中心招募了1 例宫内超声及引产后关节挛缩表现胎儿的家庭。获取了胎儿肌肉组织、父母双方外周血DNA 和详细临床资料。随访该家庭第二胎情况。

2基于二代测序的目标外显子检测 引产后取胎儿组织1 g 进行冷冻切片，夫妻双方外周血4 mL存于EDTA 管。应用试剂盒(天根) 提取基因组DNA。采用IDT 公司xGen® ExomeResearch Panel v1.0 捕获芯片获取目标基因，Illumina Hiseq Xten平台测序。应用分析软件BclToFastq 得到原始数据(raw data)，使用BWA 与NCBI 人参考基因组(hg19)进行比对。使用Samtools 与Pindel 检测及注释单核苷酸多态性(SNPs)和序列的插入或缺失(InDels)，根据ACMG 发布的方案评估变异的致病性[7]。对目标序列进行PCR 后，经ABI3730 测序仪进行Sanger 测序验证，并经序列分析软件得到验证结果。xGen® ExomeResearch Panel v1.0 芯片是基于罗氏芯片，参考Omim 数据库，使用91867 个探针于3372 个基因外显子区域捕获共7465978 bp，该外显子区域与4213 个已知的符合孟德尔遗传规律的疾病相关。

结果

1孕妇及胎儿情况孕 妇28 岁，孕2 产2，2015 年第一胎系自然妊娠；无危险因素暴露史；夫妇身体健康，无血缘关系；无家族遗传病史。胎儿于孕24+1周行超声提示：股骨长3.75 cm，接近同孕周标准股骨长度-2SD[8]。肱骨偏短(2.56 cm)，于孕25+2周引产。娩出后体表尸检可见多发畸形，包括额部宽阔，额中部突出，鼻梁凹陷、面中部扁平、小下颌，双侧肘关节、膝关节挛缩固定，双拇指呈铲状指，双手指末端关节固定挛缩，双侧踝关节扭曲固定，脚背部过伸、马蹄足畸形，双侧大脚趾末端明显膨大。行X 线检查可见双侧轻度弯曲的股骨，两侧干骺端膨大，颈1 椎体与颈2 椎体间隙增宽，腰4、腰5 椎体见纵向裂缝(图1)。2018 年第二胎系自然受孕，孕期超声未提示异常，足月顺娩一活男婴，现体健，无异常表型。

图1 引产儿超声、X 线及体表检查表型A：X 线片正面观可见双侧轻度弯曲的股骨，两侧干骺端膨大；B：X 线片侧面观可见颈1 椎体与颈2 椎体间隙增宽(橙色箭头)，腰4、腰5 椎体见纵向裂缝(绿色箭头)；C：引产儿超声图可见小下颌；D：引产儿超声图股骨长3.75 cm；E：引产儿超声图双足底与小腿长轴可在同一水平面显示，右足底足尖朝内，左足底足尖朝外；F：引产儿超声图，肱骨短，长约2.56 cm；G：引产儿全身观，额部宽阔，额中部突出，鼻梁凹陷，面中部扁平，小下颌，双侧肘关节、膝关节挛缩固定，双侧踝关节扭曲固定，脚背部过伸、马蹄足畸形；H：引产儿半身观，可见额部宽阔，额中部突出，鼻梁凹陷、面中部扁平、小下颌，双拇指呈铲状指，双手指末端关节固定挛缩；I：引产儿右足，踝关节扭曲固定，脚背部过伸、马蹄足畸形，双侧大脚趾末端明显膨大；J：引产儿左足；K：引产儿左手，拇指呈铲状指，手指末端关节固定挛缩Fig.1 Ultrasound,X-ray and body examination results of the fetus A:Front X-ray view showing bilateral slightly curved femurs with both metaphysis distended;B:Lateral X-ray view showing widening of the space between C1 and C2 centrum (orange arrow),coronal clefts in L4 and L5 centrum (green arrow);C:Ultrasonography of the fetus showing micrognathia;D:Ultrasonography of the fetus shows the femur length is 3.75 cm;E:Ultrasonography of the fetus shows the long axis of both plantar and leg can be displayed on the same horizontal plane,with the right plantar apex facing inward and the left plantar apex facing outward;F:Ultrasonography of the fetus shows the length of humerus is 2.56 cm;G:Appearance of the proband:broad forehead,prominent middle forehead,depressed nasal bridge,flatten middle face,micrognathia,contracture and fixation of bilateral elbow and knee joints,spatulate thumbs,contracture of bilateral distal interphalangeal joint,bilateral wrist joints extension contracture and talipes;H:Appearance of the fetus(half length):broad forehead,prominent middle forehead,depressed nasal bridge,flatten middle face,small lower jaw,contracture of bilateral distal interphalangeal joint,spatulate thumbs;I:Appearance of the right foot of the fetus:bilateral wrist joints extension contracture and talipes,and obviously enlargement of the bilateral big toes;J:Appearance of the right foot of the fetus;K:Appearance of the left hand of the fetus:contracture of bilateral distal interphalangeal joint,spatulate thumbs

2畸形胎儿基于二代测序的目标外显子检测 通过4000 种人类孟德尔遗传病NGS panel 检测，在引产儿肌肉组织中检测出FLNB c.565T＞C(p.189，W＞R)杂合突变。生物信息学分析表明，这种错义突变具有致病性。c.565(E3)T ＞C 可引起第189 位的色氨酸变为精氨酸，这可能导致蛋白产物氨基酸序列第1～239 位肌动蛋白结合结构域(ABD)及第139～239 位中的钙蛋白同源结构域(CH2)功能丢失。该突变位于内外显子交界，可能引起剪切位点的改变，从而导致蛋白结构的严重改变。该蛋白从人类至热带爪蟾高度保守。此突变在1000 genome Project、ExAC 等数据库中未见报道，在其他文献中有致病性报道。

3家系一代测序位点验证 经一代测序确定，其父母为野生型，后期随访中第二胎的羊水经一代测序验证同位点为野生型，符合常染色体显性遗传特征。从而提示引产儿可能患有拉森综合征(Larsen syndrome OMIM 150250)[2,9]。见图2。

图2 FLNB 基因突变分析A：FLNB 的基因组结构。突变位于外显子3 内，图中省略了第5～39 号外显子；B：部分FLNB 编码蛋白结构，黑色标记为突变位置，p.189,W＞R；C：一代测序图证实引产儿存在c.565（E3）T＞C 突变，其父母为野生型；D：蛋白保守性分析提示在人类、黑猩猩、恒河猴、家鼠、红色原鸡、河豚和非洲爪蟾中均有保守性Fig.2 Mutation analysis of FLNB A:Genomic structure of FLNB:the mutations was identified in exon 3;B:Part of the FLNB-encoded protein structure is shown,with the mutation site marked by blue arrow (p.189,W＞R);C:Sequence chromatogram confirmed that the fetus had the heterozygosis mutation,while the parents had wild type gene;D:The conserved protein analysis indicated that it was conserved in human,Ptroglodytes,Mmulatta,Mmusculus,Ggallus,Trubripes and Xtropicalis

讨论

FLNB 基因(OMIM 603381)位于3 号染色体p14.3，最早于1998 年被Takafuta 等[10]发现。编码包含2602 个氨基酸的丝蛋白B(Filamin B)，一种多域单体蛋白[11]。包括由两个钙蛋白同源结构域(CH1 和CH2) 构成的肌动蛋白结合结构域(ABD)，以及一个由24 个同源重复序列组成的杆状结构域，其中分别有两个重复序列15 和16 以及重复序列23 和24 链接成的铰链结构(hinge-1和hinge-2)[12]。该蛋白在骨骺生长板软骨细胞中表达，作为一种多功能信号支架与多种受体、通道、细胞内信号分子和转录因子相互作用，如肌动蛋白、丝状蛋白结合蛋白-1(FBLP-1)、早老蛋白和糖蛋白Ibα(GPIbα)，对正常细胞生长、分裂(增殖)，软骨细胞成熟(分化)骨化有重要意义[13-14]。

FLNB 的突变与一组骨骼发育不良疾病(SCT，LS-AO-BD)相关[15-16]。该组疾病一般分为两种，一种为纯合突变或复合杂合突变导致的常染色体隐 性遗传疾病Spondylocarpotarsal synostosis 综合征 (spondylocarpotarsal syndrome，SCT ；OMIM 272460)；另一种为常染色体显性遗传的骨发育不全征Ⅰ型和Ⅲ型(atelosteogenesis ⅠAOⅠ；OMIM 108720；atelosteogenesis Ⅲ，AOⅢ；OMIM 108721)，回飞镖样骨发育不全症(boomerang dysplasia，BD；OMIM 112310)及拉森综合征(Larsen syndrome；OMIM 150250)，统称LS-AO-BD 疾病[12,17-19]，其中AOⅢ的少数个体可存活，AOⅠ和BD 胎儿均死亡[20]。目前认为常染色体隐性遗传的SCT 与常染色体显性遗传的LS-AO-BD 疾病在发生机制上存在差异。前者主要表型为身材矮小、脊柱侧凸前凸、腕/跗骨关节融合、肋骨缺失畸形，往往是因蛋白质截短，导致蛋白表达缺失，后者常因CH2 区和第一杆状结构域的氨基酸改变引发；而且SCT 杂合突变携带者往往无明显症状或轻微表型，这提示LS-AO-BD 疾病可能与杂合突变造成的基因功能不全无关[10,21-22]。有学者筛选出FLNB中致病性相对较高的位点(W148R，F161C 和L171R)进行蛋白结构对比与分析，提示这些致病变异可能会改变蛋白的结构与性质，从而使肌动蛋白-丝蛋白间的相互作用失调[10]。但LS-AO-BD疾病具体的发病机制仍待进一步研究。

本文中通过panel 家系检测在引产儿中发现FLNB c.565(E3)T＞C(p.189,W＞R) 杂合突变，该错义突变引发的氨基酸改变位于钙蛋白同源结构域(CH2)内，可导致肌动蛋白结合结构域及钙蛋白同源结构域(CH2)的功能丢失，形成的异常蛋白可干扰软骨细胞正常增殖或分化，影响骨化并导致拉森综合征表型出现[23]。引产儿表型中包含明显的小下颌、双侧肘关节和膝关节挛缩固定、双拇指呈铲状指、双手指末端关节固定挛缩、马蹄足畸形。双侧大脚趾末端明显膨大等拉森综合征(Larsen syndrome OMIM 150250)的表现[2]。其父母及第二胎为野生型，无临床表型，符合常染色体显性遗传特征。有文章报道FLNB c.565T＞C 突变与骨发育不良Ⅰ型(atelosteogenesis，typeⅠAOⅠ；MIM 108720)有关[24]。但该胎儿表型及X 线片特征并未出现典型骨发育不良Ⅰ型表型(窄胸廓、肱骨、股骨远端发育不良、胸椎发育不良等[15])。同时也有文献报道c.502G＞T(G168C) 突变与LS、AOⅠ和AOⅢ三种疾病有关[2,13,17]。这种的交叉性的具体成因尚不清楚，可能仍需要对变体蛋白进行结构与功能的研究，以建立表型与基因型之间的关系[12]。

此外，通过panel 我们还发现了引产儿FLNB c.6773(E41)C＞G(p.2258,S＞C)杂合突变，与父亲基因型相同，母亲野生型，不符合家系共分离。COL2A1 c.2999(E43)C＞T(p.1000，P ＞L)，c.1913(E29)C＞T(p.638，T＞I) 复合杂合突变，与母亲基因型相同，父亲为野生型。COL2A1 突变可导致骨发育不全Ⅱ型(osteogenesis imperfecta typeⅡ OⅢMIM 166210)，为常染色体显性遗传。主要表型为短肋、严重的四肢短小，常在胎儿期死亡[25-27]，与引产儿表型不符，且不符合家系共分离表现。故不考虑骨发育不全Ⅱ型诊断。