齐志涛，方建国，王娥娥，郝苏云，高艳华，路 荣，赵丽霞， 范秀丽，张燕红，杜宇荣，宋庆庆，陈九连

(金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特 010100)

塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)是近年来新发的一种猪传染病，猪感染后发病症状与口蹄疫相似，典型症状为鼻盘、蹄冠出现肿胀、水疱或破溃[1]，在临床上与口蹄疫难以区分。SVA在我国不同区域广泛分布，随着SVA在猪群当中的不断传播，其毒力在逐渐减弱，造成猪群发生亚临床感染[2]，严重威胁我国养猪业的发展及市场交易。目前我国尚无商品化疫苗用以预防该病的发生与传播，相关产品还处于研发阶段。在疫苗研发过程中，产品免疫效力的检验是至关重要、不可或缺的环节，SVA灭活疫苗的效力检验主要依靠本动物进行。近年来，受非洲猪瘟的影响，猪的买卖和运输受限，造成实验猪的采购比较困难，导致SVA灭活疫苗的研发工作受阻。因此，为保障疫苗研发工作的顺利进行，同时也积极响应3R原则[3]，本研究选用豚鼠和家兔这两种数量多、价格低、运输便捷的动物，开展豚鼠、家兔与猪免疫SVA灭活疫苗后的血清中和抗体相关性研究，以期在节约成本、提高效率、保障动物福利的同时，为兽用疫苗效力检验工作中实验动物替代方法的应用提供支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 SVA灭活疫苗(悬浮培养，批号为2019001)、用于做中和试验的SVA病毒液CH/ZZ/2016株、PK-15细胞(猪肾细胞)，由金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室保存。体重300～500 g的豚鼠和1.5～2.0 kg的家兔各50 只，购自呼和浩特某养殖场；60 日龄以上架子猪15 头，购自呼和浩特市和林格尔县某养猪场。

1.2 豚鼠免疫及SVA中和抗体检测 将50只豚鼠随机分为5组，分别以0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL的免疫剂量对其中4组豚鼠采用腿部肌肉注射方式免疫，1组作为对照，以相同方式注射2.0 mL生理盐水。分别于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天连同对照组豚鼠一并采血，分离血清，以《中华人民共和国兽药典》中的中和试验法[4]测定SVA中和抗体，数据呈现形式采用log2N表示。

1.3 家兔免疫及SVA中和抗体检测 将50只家兔随机分为5组，分别以0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL的免疫剂量对其中4组家兔采用腿部肌肉注射方式免疫，1组作为对照，以相同方式注射2.0 mL生理盐水。分别于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天连同对照组家兔一并采血，以中和试验法[4]测定SVA中和抗体，数据呈现形式采用log2N表示。

1.4 猪免疫及SVA中和抗体检测 选取15头猪，将其中10头以最佳免疫方法，即颈部肌肉注射方式免疫2.0 mL SVA灭活疫苗，另外5头作为对照，以相同方式注射2.0 mL生理盐水。分别于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天连同对照组猪一并采血，分离血清，以中和试验法[4]测定SVA中和抗体，数据呈现形式采用log2N表示。

1.5 豚鼠SVA中和抗体与猪SVA中和抗体相关性分析 分别计算每组豚鼠及猪免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天的平均中和抗体滴度，利用Microsoft Excel软件对所得结果进行整理，初步分析豚鼠、家兔与猪血清中SVA中和抗体之间的线性关系，并进一步采用IBM SPSS Statistics 19软件对线性关系的显著性进行分析。

1.6 家兔SVA中和抗体与猪SVA中和抗体相关性分析 分别计算每组家兔及猪免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天的平均中和抗体滴度，利用Microsoft Excel软件对所得结果进行整理，初步分析豚鼠、家兔与猪血清中SVA中和抗体之间的线性关系，并进一步采用IBM SPSS Statistics 19软件对线性关系的显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 豚鼠免疫后SVA中和抗体检测结果 对照组豚鼠SVA中和抗体滴度为0，豚鼠免疫后SVA中和抗体滴度呈升高趋势，高剂量免疫组豚鼠SVA中和抗体滴度高于低剂量免疫组；2.0 mL免疫组豚鼠SVA中和抗体上升速度较其他组快，且SVA中和抗体滴度最高，免疫后第28 d豚鼠SVA平均中和抗体滴度可达210.5，其次为1.0 mL免疫组，免疫后第28 d SVA平均中和抗体滴度达210.3；0.5 mL免疫组在免疫后第28 d平均中和抗体滴度为28.3；0.25 mL免疫组平均抗体滴度最低，免疫后第28 d SVA平均中和抗体滴度为26.3；对照组SVA中和抗体滴度为0(图1)。结果表明，豚鼠免疫SVA灭活疫苗后，可产生SVA中和抗体，且随着免疫剂量的增加和时间的延续，SVA中和抗体滴度逐渐升高。

2.2 家兔免疫后SVA中和抗体检测结果 家兔免疫后SVA中和抗体变化情况与豚鼠免疫后相似，各组家兔在免疫后SVA中和抗体滴度均呈升高趋势，高剂量免疫组家兔SVA中和抗体滴度高于低剂量免疫组；2.0 mL免疫组家兔SVA中和抗体滴度高于其他组，在免疫后第28 d家兔SVA平均中和抗体滴度达210.0，其次为1.0 mL免疫组，免疫后第28 d平均中和抗体滴度达27.5；0.5 mL免疫组在免疫后第28 d平均中和抗体滴度为27.16；0.25 mL免疫组SVA平均中和抗体滴度最低，免疫后第28 d为25.0(图2)。结果表明，家兔在免疫SVA灭活疫苗后，也可产生SVA中和抗体，且随着免疫剂量的增加和时间的延续，SVA中和抗体滴度逐渐升高。

图1 各组豚鼠SVA中和抗体检测结果Fig 1 Test results of SVA neutralizing antibodies of guinea pigs

图2 各组家兔SVA中和抗体检测结果Fig 2 Test results of SVA neutralizing antibody of rabbits

2.3 猪免疫后SVA中和抗体检测结果 随着时间的推移，免疫猪SVA中和抗体滴度逐渐上升，免疫后第28 d SVA平均中和抗体滴度可达28.0，对照组中和抗体为0(图3)。结果表明，猪免疫SVA灭活疫苗后可产生SVA中和抗体，且随着免疫时间的延续，SVA中和抗体滴度逐渐升高。

图3 猪免疫后SVA中和抗体检测结果Fig 2 Test results of SVA neutralizing antibody of pigs

2.4 豚鼠SVA中和抗体与猪SVA中和抗体相关性分析结果 以猪SVA平均中和抗体值为纵坐标，分别以豚鼠0.25 mL免疫组、0.5 mL免疫组、1.0 mL免疫组及2.0 mL免疫组SVA平均中和抗体值为横坐标做散点图，绘制猪SVA中和抗体与各免疫组豚鼠SVA中和抗体的回归曲线，对二者是否存在关系进行初步判断。图4结果显示，各组豚鼠在免疫后SVA中和抗体在一定程度上与免疫猪SVA中和抗体呈正相关，其中豚鼠1.0 mL免疫组SVA中和抗体与免疫猪SVA中和抗体极显著相关(R2= 0.9942，P<0.01)；豚鼠0.5 mL免疫组SVA中和抗体与猪SVA中和抗体显著相关(R2= 0.9833，P<0.05)；豚鼠2.0 mL免疫组SVA中和抗体与猪SVA中和抗体显著相关(R2= 0.9818，P<0.05)；豚鼠0.25 mL免疫组SVA中和抗体与猪SVA中和抗体相关性不显著(R2= 0.961，P>0.05)。结果表明，豚鼠SVA中和抗体与猪SVA中和抗体存在线性相关关系，当豚鼠免疫剂量为1.0 mL时，可通过线性回归方程(y= 0.8131x-0.0971)评估该疫苗在猪体的SVA血清中和抗体水平及消长规律。

图4 豚鼠与猪SVA中和抗体回归曲线Fig 4 Regression curve SVA neutralizing antibody between guinea pigs and pigs

利用IBM SPSS Statistics 19软件对各组豚鼠与猪SVA中和抗体相关性的差异显著性，结果见表1。各组豚鼠免疫后SVA中和抗体效价均与猪的中和抗体效价存在一定相关关系，其中，豚鼠1.0 mL免疫组SVA中和抗体效价与猪的SVA中和抗体效价相关性最显著，相关性为0.990(P<0.01)，属于极显著相关；豚鼠2.0 mL免疫组SVA中和抗体效价与猪的SVA中和抗体效价相关性为0.988(P<0.05)，属于显著相关；豚鼠0.5 mL免疫组SVA中和抗体效价与猪的SVA中和抗体效价相关性为0.973(P<0.05)，也属于显著相关；豚鼠0.25 mL免疫组SVA中和抗体效价与猪的SVA中和抗体效价相关性为0.913(P>0.05)，无统计学意义。结果表明，豚鼠1.0 mL免疫组SVA中和抗体与猪SVA中和抗体相关性最显著，且这种相关性具有统计学意义。

表1 豚鼠与猪SVA中和抗体相关性分析Tab 1 Correlation analysis of SVA neutralizing antibody between guinea pigs and pigs

2.5 家兔SVA中和抗体与猪SVA中和抗体相关性分析结果 以猪SVA平均中和抗体值为纵坐标，分别以家兔0.25 mL免疫组、0.5 mL免疫组、1.0 mL免疫组及2.0 mL免疫组SVA平均中和抗体值为横坐标做散点图，绘制猪SVA中和抗体与各免疫组家兔SVA中和抗体的回归曲线，对二者是否存在关系进行初步判断，结果见图5。各组家兔在免疫后SVA中和抗体在一定程度上与免疫猪SVA中和抗体呈正相关，其中家兔1.0 mL免疫组SVA中和抗体与免疫猪SVA中和抗体极显著相关(R2=0.9942，P<0.01)；家兔2.0 mL免疫组SVA中和抗体与猪SVA中和抗体极显著相关(R2=0.9885，P<0.01)；家兔0.5 mL免疫组、0.25 mL免疫组SVA中和抗体与猪SVA中和抗体相关性不显著(P>0.05)。结果表明，家兔SVA中和抗体与猪SVA中和抗体存在线性相关关系，当豚鼠免疫剂量为1.0 mL时，可通过线性回归方程(y= 0.813x+0.0971)评估该疫苗在猪体的SVA中和抗体水平及消长规律。

图5 家兔与猪SVA中和抗体回归曲线Fig 5 Regression curve SVA neutralizing antibody between rabbits and pigs

利用IBM SPSS Statistics 19软件对各组家兔与猪SVA中和抗体相关性紧密程度进行分析，结果见表2。各组家兔免疫后SVA中和抗体效价均与猪的中和抗体效价存在一定相关关系，其中，家兔1.0 mL免疫组SVA中和抗体效价与猪的SVA中和抗体效价相关性最显著，相关性为0.998(P<0.01)，属于极显著相关；家兔2.0 mL免疫组SVA中和抗体效价与猪的SVA中和抗体效价相关性为0.988(P<0.05)，也属于极显著相关；家兔0.5 mL免疫组SVA中和抗体效价与猪的SVA中和抗体效价相关性为0.859(P>0.05)，无统计学意义，相关性不显著；家兔0.25 mL免疫组SVA中和抗体效价与猪的SVA中和抗体效价相关性为0.920(P>0.05)，无统计学意义，相关性不显著。结果表明，家兔1.0 mL免疫组SVA中和抗体与猪SVA中和抗体相关性最显著，且这种相关性具有统计学意义。

3 讨论与结论

应用动物试验替代方法对兽用疫苗检验逐渐发展为许多研究人员的共识，一些学者认为，动物试验替代方法是疫苗检验工作的必然发展趋势[5]。理论上讲，若替代动物对疫苗抗原的血清学反应存在明确的量效关系，该动物即可成为疫苗效力检验的替代动物[6]。疫苗的效力检验不一定必须进行本动物攻毒实验，替代方法建立的关键在于建立与传统检验方法的平行关系，并且这种平行关系是稳定的，不会随着产品批次的变化而发生改变，进而实现等效替代，建立质量标准[6]。

表2 家兔与猪SVA中和抗体相关性分析Tab 2 Correlation analysis of SVA neutralizing antibody between rabbits and pigs

豚鼠和家兔是常用的试验动物，具有价格低、数量多、运输便捷等优势。欧洲兽药典列出多种用豚鼠或家兔替代方法[7]，我国关于兽用疫苗效力检验和安全检验的替代方法也在不断进步，部分疫苗效力检验和安全检验中的本体动物逐渐被豚鼠、兔等实验动物替代[4]。比如，在猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验中，通过兔体定型热来代替猪体试验；在猪圆环病毒2型灭活苗检验中，通过免疫鼠、兔替代本体动物，从而解决试验动物筛选难的问题[8]。

本研究以豚鼠和家兔为试验动物，以血清学试验评价SVA灭活疫苗免疫效力，发现豚鼠和家兔接种SVA灭活疫苗后，均可产生SVA中和抗体，并且抗体滴度随着免疫剂量的增加而升高，说明豚鼠与家兔可对该疫苗产生血清学反应，并且血清学反应存在明显量效关系，证明了用豚鼠或家兔替代猪检验SVA灭活疫苗效力的可行性。在进一步的统计学分析后发现，豚鼠和家兔在免疫1.0 mL SVA灭活疫苗后，产生的SVA中和抗体与猪产生的SVA中和抗体具有显著的线性关系，并且可获得回归方程。从而推测，可通过免疫豚鼠或家兔间接反应SVA灭活疫苗在猪体的中和抗体水平，但具体质量标准的建立还需要进一步研究。