杨亚兰，张震阳，谢元栋，李泽华，刘晓莉，李 毅

肿瘤、创伤、感染、牙周疾病等可引起颌面部骨组织缺损，植骨术作为常用的治疗手段，存在骨供体有限、疾病传播、免疫排斥、可能导致供体区并发症等问题[1]。在这种背景之下，骨组织工程逐渐兴起，它利用工程学和生命科学的原理开发骨替代物，为修复口腔骨缺损，重建其功能提供了一种新型手段。骨组织工程包括三个要素：支架、细胞和生长信号。支架通过模拟细胞外基质的微环境，为细胞生长、分化和骨组织形成提供结构支持。为了满足骨组织工程的需要，理想的支架应具有生物降解性、机械稳定性、骨传导性、骨诱导性及3D多孔结构等特征，而现有的纯支架材料存在机械强度低、抗降解性差等问题，因此常采用交联法对支架进行改性。

交联诱导支架材料与交联剂发生反应，形成氢键、离子键或者共价键，从而改善支架材料性能[2]。目前，交联分为三种方式：物理交联、化学交联和酶交联。由于物理交联的效率较低、交联键弱，酶交联的费用高昂、具有底物特异性，而化学交联能够产生均匀而高效的交联且成本适中[3]，因而化学交联成为了目前的研究热点。口腔骨组织工程中常用的化学交联剂主要分为合成交联剂和天然交联剂。本文就一些常用化学交联剂的特点、机制及应用作一综述。

1 常用交联剂的特点及交联机制

1.1 合成交联剂

1.1.1 戊二醛 戊二醛(glutaraldehyde，GTA)是一种同型双功能交联剂，它的两个醛基能够与蛋白质、多糖等聚合物的氨基或羟基发生反应[4]，形成稳定的共价键。

GTA具有成本低、反应效率高等优点，常采用蒸汽或溶液形式进行交联[5]。GTA蒸汽多用于交联多孔材料，避免了在材料中产生表面张力，无需反复冷冻干燥[6]，但它交联材料费时，且会受材料厚度影响而导致交联不良。GTA溶液交联材料速度相对较快，且交联效果好，但残留的GTA难以完全清除。GTA的醛基能够与细胞蛋白质、脂质、核酸发生反应导致细胞损伤甚至凋亡，引起宿主组织的炎症和钙化[7]，具有高细胞毒性，因而限制了其在材料改性中的应用。

目前，学者们针对GTA的细胞毒性，提出了一些降低其毒性的策略。如用蒸馏水、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline, PBS)反复冲洗，并用甘氨酸[7]、赖氨酸等氨基酸溶液或硼氢化钠溶液中和支架上游离的醛基[8]。Casali等[9]发现用超临界CO2对交联的胶原膜处理仅1 h，即可去除超过95%的残留GTA，且未影响胶原膜原有的机械性能。尽管上述方法能够在一定程度上降低GTA交联支架的毒性，但仍无法解决GTA从支架中逐渐释放所带来的毒性影响。

EDC是一种“零长度”交联剂，即在介导两个分子交联时，不会引入新的物质，在反应结束后，它本身不留在支架中，而是转变成一种细胞毒性极低的尿素副产物，这种副产物与过量的EDC可以通过稀酸或水从支架上洗涤去除[11]。通常将N-羟基琥珀酰亚胺与EDC联用以减少副反应，稳定中间产物[12]。

同样，EDC也具有一定的局限性。首先，EDC在交联过程中会消耗支架材料中细胞识别所需的氨基酸侧链，影响细胞对支架的粘附[13]。针对这一缺点，Malcor等[14]将含有细胞结合位点的三螺旋肽结合到胶原膜支架上，增强细胞的粘附和扩散；Bax等[13]将EDC与紫外线辐射结合交联胶原膜，减少EDC的用量，保留细胞识别位点，增强细胞对支架的粘附，同时紫外线诱导胶原的芳香族侧链交联，维持胶原膜的力学性能。其次，与GTA相比，EDC交联支架的机械性能及抗降解性较差[5]。另外，EDC的交联效率呈pH依赖性，在pH 4～6时交联效率最佳，在碱性条件下交联效率很低，而支架上的氨基基团在碱性条件下则反应活性更好，这可能会影响EDC对支架的改性效率[10]，后述的两个问题仍有待进一步的研究。

1.2 天然交联剂

1.2.1 京尼平 京尼平(genipin，GP)是一种从栀子果实中提取出来的栀子苷水解产物，其毒性比GTA低[15]。GP具有多个活性基团，如羟基和羧基，能够自发地与蛋白质、壳聚糖等的伯胺基发生反应[16]。GP在交联时会发出荧光，可通过监测荧光强度来追踪交联效率及支架降解情况[17]。

GP交联效率与GTA相近，且细胞毒性较小，是一种有前景的交联剂，但GP的细胞毒性具有剂量依赖性及种属、细胞特异性，高浓度时可影响细胞活性，甚至导致细胞死亡[18]，低浓度时对部分细胞仍有明显细胞毒性[19]。因此在应用时应将使用剂量、交联效果与细胞毒性综合考虑。另外，由于GP的产量低、价格昂贵，限制了其推广，目前主要用于实验研究，因此GP的提取步骤有待优化，提取产量有待提高。

1.2.2 柠檬酸 柠檬酸(citric acid，CA)是一种有机三羧酸，可以从植物中的柠檬、柑橘及动物的骨骼、牙齿等物质中提取出来。CA的三个羧基可与氨基和羟基反应，形成较为稳定的共价键，从而为多糖和蛋白质等提供交联[20]。CA脱氢后产生的共轭碱基可以参与三羧酸循环[21]，并且支架降解释放的CA片段可作为细胞的营养物质，因此CA具有良好的生物相容性。此外，CA基聚合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抑菌作用，这归因于CA基聚合物中柠檬酸盐衍生的大量游离羧基能螯合细胞壁中的金属离子，改变细胞壁的通透性，影响细菌对营养的吸收，从而导致细胞损伤然后死亡[22]。

1.3 其他交联剂

1.3.1 环氧化合物 环氧化合物(epoxy compounds，ECs)是一种具有三元环醚结构的化合物，在酸或碱的催化下可与聚合物中的氨基、羟基、羧基等官能团产生开环反应[23]，发生三点交联，生成具有三维网状结构的大分子，故采用ECs交联的支架材料机械性能表现优良。目前，ECs常用于心脏瓣膜、气管、血管等部位支架的改性，经其处理的生物材料具有良好的生物相容性、柔韧性及亲水性、较低的免疫原性、较强的抗钙化能力[24]。ECs在交联过程中可能会因为交联不完全而残留环氧基，后者具有一定的细胞毒性，但通过处理，环氧基易水解生成羟基，其细胞毒性降低[25]，能够满足医用材料的安全要求。由此可见，采用ECs交联的支架材料综合性能优良。目前常用的ECs有乙二醇二缩水甘油醚(商用环氧树脂)、聚乙二醇二缩水甘油醚等。

1.3.2 低聚原花青素 原花青素是一类可从多种植物(如花生皮、葡萄籽)中提取出来的多酚类化合物，由单体儿茶素通过碳—碳键聚合而成，其中聚合度小于10的聚合物称为低聚原花青素(oligomericproanthocyanidins，OPCs)。OPCs含有多个酚羟基，多通过与其他聚合物之间形成非共价键(如氢键)发挥交联作用。研究发现，OPCs能够增强胶原蛋白网络的交联密度，从而增强牙本质弹性模量[26]。天然来源的OPCs对细胞的毒性很小，甚至能够促进细胞增殖[27-28]。此外，OPCs有一定的抗炎作用。活性氧作为一种炎症信号因子及炎性介质，在浓度较高时会导致伤口缺血性修复不良，而富含羟基的OPCs具有强大的抗氧化性，从而加速伤口愈合[29]。

2 在口腔骨组织工程支架改性中的应用

2.1 改善机械性能

骨组织工程支架对力学性能的要求较为复杂，需具有抗压缩、抗拉伸、抗疲劳等特性，以承受负荷，维持缺损部位的空间结构，为组织新生提供结构支持。Yang等[5]比较了GP、GTA、EDC对明胶海绵支架交联后压缩弹性模量的影响，结果表明，三个交联组的机械强度明显提高，干燥状态下均达到700 kPa以上，在湿润状态下，GP和GTA组的压缩模量显著高于EDC组。这提示着GP和GTA的交联效率相当，能够与明胶产生高度交联，在湿润状态下溶胀程度较小，从而保持较高的机械强度。Babo等[30]制备了经GP交联的血小板裂解物(platelet lysate，PL)支架。PL来源于血清，机械强度较差。PL经交联后不会发生收缩，能持续稳定释放生长因子，并表现出粘弹性，特别适用于诸如牙周膜等承受动态机械负荷的组织。

通常，支架机械强度的增加会伴随着支架孔隙率的降低。支架孔隙的大小、形状、数量、互通性等也会影响成骨效果，研究表明支架的孔径大于100 μm、孔隙率高于80%更有利于细胞和组织长入支架[31]。Goudouri等[32]分别采用GP和EDC交联，制备了孔隙彼此贯通、孔径300～600 μm及孔隙度90%以上的复合支架，这种高度多孔隙结构有利于细胞的粘附增殖、植入区域的血运重建及营养物质和代谢废物的转运，最终成功促进牙槽骨再生。

2.2 增强抗降解性能

支架材料在较长时间内维持结构稳定性至关重要，通过交联可以显著减缓其降解速度，使支架在足够长的时间内为细胞增殖、分化和骨再生提供结构支持。Yang等[5]在体外实验中比较了分别采用GP、GTA、EDC交联的明胶海绵支架的抗水解性，结果显示，未交联组在几分钟内完全溶解，而GTA和GP组1个月内几乎无质量损失，5个月后仍保留原质量的94%，EDC组的质量1个月内下降到87.3%，5个月后损失近50%。Shalumon等[31]在PBS溶液中对比了分别采用EDC和GTA交联明胶/羟基磷灰石凝胶支架的抗水解性，结果发现EDC交联组的抗水解性与GTA交联组相比较差，推测可能是由于EDC交联产生的酰胺键亲水性强，而GTA交联产生的亚胺键有更高的水解稳定性。

由于支架在植入体内后还会受到多种酶的消化，因此，除抗水解性之外，支架还需要具有一定的抗酶解性。有学者将经GTA交联的血清来源支架接种人脂肪间充质干细胞后植入大鼠下颌骨缺损处，90 d观察到支架仍有部分保留，成功诱导缺损处的骨再生[33]。随后Redondo等[34]在临床研究中验证了上述GTA交联支架修复上颌骨囊性骨缺损的能力，并且没有严重的不良反应产生。然而，有学者发现，支架材料延迟降解可能会引发炎症反应而影响再生骨骼的质量[35]。Yang等[5]的体内实验也证明了这一点，他们分别将经GTA、GP和EDC交联的支架材料植入大鼠皮下后发现，交联明显延长了支架的降解时间，免疫排斥反应较重，材料周围均有较厚的组织增生。因此，如何在通过交联提高支架抗降解性的同时保证支架的生物相容性，仍是有待解决的问题。

2.3 潜在的成骨作用

骨主要由羟基磷灰石晶体镶嵌于胶原纤维之间组成。有些交联剂除发挥交联作用外，还对新生骨形成起调节作用。研究发现CA是一种天然的磷酸钙成核分子，在矿化过程中对诱导和稳定羟基磷灰石的生长起重要作用，从而参与调节骨矿化[36]。Raucci等[37]采用CA交联制备可注射纤维素水凝胶，研究CA对成骨分化的影响。结果表明粘附于交联水凝胶表面的细胞其碱性磷酸酶活性显著提高，并且这些细胞表达骨相关标志物的基因上调。Chen等[38]将CA交联支架放入模拟体液盐溶液中，观察到支架表面有矿化球状晶体沉积，并且这些晶体的数量和大小随时间延长而增加。Shalumon等[31]分别采用EDC和GTA交联制备明胶/羟基磷灰石凝胶支架，体外实验发现EDC交联组细胞的碱性磷酸酶活性显著高于GTA组，产生的钙结节钙磷含量最高，钙磷比值最接近于理想比值(1.67)，成骨相关基因表达(碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅱ型胶原)均高于GTA组，这些表明相比GTA，EDC在促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化方面更有优势。Kulakowski等[28]采用经OPCs处理的牙本质基质培养牙髓干细胞，发现细胞内参与牙本质形成和生物矿化的关键基因(骨钙蛋白、骨形态发生蛋白-2等)上调。但CA、EDC、OPCs作为交联剂在口腔骨组织工程领域的研究较少，其成骨作用仍有待进一步研究。

2.4 其他作用

交联可以将一些具有促进骨再生、血管再生等作用的生物活性物质(如药物、生长因子)添加至支架上，并调节这些活性物质的释放速率，从而充分发挥其生物学作用。有研究表明，经交联后控制释放的生物活性物质，可以诱导更多的骨组织形成[39]。Das等[40]采用EDC将血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白-6交联至聚乳酸-乙交酯共聚物支架上，并使得两者持续释放达21 d，进一步将支架植入大鼠下颌骨的缺损部位，发现含有两种生长因子的实验组显著增强了缺损部位的骨形成以及血管增殖。交联还可将一些修饰蛋白接枝到支架材料上，对支架进行改性。Luo等[41]采用EDC将一种介导细胞粘附的整合素配体与缺乏细胞粘附配体的海藻酸盐交联，增强后者对细胞的亲和力，促进细胞粘附增殖，提高细胞存活率。

此外，交联可以修饰天然支架材料的抗原位点，降低其抗原性[42]。有研究发现，与未交联支架相比，交联支架上的骨髓间充质干细胞生长良好，细胞增殖和附着更多，并且更有利于细胞的成骨分化[43-44]。但也有学者发现支架经交联后可能会引起异物反应，从而影响组织再生[45]。因此，交联支架的生物相容性仍需更多的体内外实验验证。

3 总结及展望

骨组织工程要求支架具有足够的机械强度及抗降解性，以支撑新骨形成，化学交联剂可显著增强支架材料的上述性能，但这些性能应与细胞生长、细胞外基质分泌及骨组织再生相匹配，因此应根据骨组织生长特性选择合适的交联剂及交联条件，从而调节支架的降解速率。修复颌面骨缺损的支架其降解速率应控制在3～6个月。

此外，支架材料应具有良好的生物相容性，而当前用于支架材料改性的大多数交联剂的一些非反应性残基具有细胞毒性。目前来看，通过降低交联剂的浓度或者封闭其毒性基团来降低其细胞毒性是较为有效的方式。我们仍然需要开发新的交联方法及交联剂，探索交联参数，以制备机械性能、抗降解性和生物相容性俱佳的支架材料。