王玉明 李贺

变应性鼻炎（AR）是一种由IgE 介导的鼻部症状性疾病，其特征是鼻痒、打喷嚏、流清涕和鼻塞。是Th2 细胞优势分化及其细胞因子过度表达引起的疾病[1]。Th 细胞分化的特异性转录因子为T-bet 与GTAT-3，对 Th1/Th2 细胞的转化有关键性作用[2]，其在变应性鼻炎患者中表达明显增高[3]。转录因子T-bet 低表达和GATA-3 过表达之间，主要表现的是GATA-3 的表达明显增强，导致血浆中其相应的细胞因子IFN-γ 的含量减少和IL-4 含量增多，呈现出鼻痒、喷嚏、清水鼻涕等变应性鼻炎的临床症状.AR 发生的基因基础可能是GATA-3/T-bet 表达比例失衡，治疗AR 的关键所在可能是纠正调节二者的比例失衡[4]。麻黄附子细辛汤源自张仲景的《伤寒杂病论论·辨少阴病脉证并治》[5]，是治疗少阴病的效方。为少阴与太阳合病，外感之寒凉由太阳直透少阴所致反发热，脉沉者，麻黄以解表寒，附子解里寒，佐以辛温香窜之细辛，既能助附子解里寒，又能助麻黄以解外寒，俾其自太阳透入之寒，仍由太阳作汗而解。耳鼻喉科临床上将此方应用于虚寒型AR 治疗效果可靠，是耳鼻喉学者公认的有效方剂。《伤寒杂病论》中的经典方配伍都非常严谨，药味少而精。要开发经方，深研其内在作用机制，更准确的指导和应用于临床实践，研究者一是从实验的层面在基因分子作用机制上进行深入探究，一是将在变应性鼻炎的临床应用上进行科学而严谨的临床观察。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物

挑选3 月龄清洁级的50 只健康豚鼠（供应商：鲁抗医药股份有限公司，合格证号为：SCXK 鲁20B0001），体重约 250g 左右，雌雄各半，按照随机表分法分为五组，每组各10 只。

1.2 所选实验药物

治疗药物：麻黄附子细辛汤（由山东中医药大学附属医院制剂室提供），组成：炮附子9g、麻黄6g、细辛3g。阳性对照药物：地塞米松（批准文号：国药准字H37020290），山东新华制药股份有限公司。

1.3 实验试剂及仪器

豚鼠皮质酮(CORT)酶联免疫检测试剂盒（货号C80635-09）、豚鼠17-OHCS 酶联免疫检测试剂盒（货号O80152-09）、豚鼠可溶性免疫球蛋白A(SIGA)酶联免疫检测试剂盒（货号S80751-09）均由Scbt公司提供（分装）；GATA-3 抗体免疫组化法批号：bs-1452R 生产厂家：北京博奥森；RT-PCR 试剂盒，批号：DRR047A，生产厂家：大连宝生物；GATA-3 引物、β-actin 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 肺气虚寒模型及AR 模型的建立

2.2.1 肺气虚寒模型建立

依据烟熏法[6]造模及樊雅莉等[7]虚寒证药物造模的方法，先行虚寒症造模：按照龙胆草∶石膏∶知母∶黄柏=1.2∶2∶1.5∶1 比例，加工成煎剂浓度为 200%，按照每天2 次，每次每只3ml 灌胃，从第17d 起改为每天3 次。用药一共28d。从灌胃的第13d 起同时加用烟熏法进行肺气虚寒证候造模，连续进行15d 烟熏：用特制玻璃烟熏造模箱，体积为80cm×50cm×50cm，河南南阳艾绒厂提供的长120mm，内含硫磺粉7g、艾绒30g 的特制烟熏艾条。每日上午10:00 及下午15:00 将豚鼠放入点燃艾条的烟熏箱，烟熏30min/次。共用时28d 完成肺气虚寒证候造模。

2.2.2 AR 模型的建立

参考文献造模方法[8，9]在肺气虚寒证造模成功后行变应性鼻炎造模：用1ml 生理盐水将氢氧化铝粉末30mg 及卵清蛋白（OVE）0.3mg 溶解制成均匀混悬液，隔日1 次，对大鼠腹腔注射做基础致敏，共7 次。再以5%卵清蛋白(OVE)溶液滴双侧鼻腔，共7d，每天一次，每侧50μL。最后一次滴鼻后记录豚鼠1/2h 内挠鼻、打喷嚏及流涕等症状，用叠加法来计算鼻炎的症状得分，评分大于5 则说明AR 模型造模成功。

3 麻黄附子细辛汤各拆方组和地塞米松对照组干预治疗

3.1 麻附辛各拆方水煎液制备

各配伍拆方组：1 号组全方：麻黄、附子、细辛；2号组方：附子、麻黄；3 号组方：细辛、麻黄。原方：麻黄二两去节，细辛二两，附子一枚炮去皮破八片。将各组方的中药饮片按照原方比例，遵循《方剂学》[10]中：“上三味，以水一斗，先煮麻黄，减二升，去上沫，内诸药，煮取三升，去滓”，把细辛、附子、麻黄的中药饮片分别加水浸泡半h 后，先将麻黄煮20min，过程中随时去除浮沫，再将泡好的细辛和附子加入一起煮30min，用4 层纱布进行粗滤渣,其它各配伍拆方的煎法与此相同，煎煮的过程中要时刻冷凝回收气体，各拆方组均以含麻黄生药0.5g/ml 为标准，进行水浴浓缩致各配伍拆方组中麻黄、附子、细辛的生药质量浓度与原方中各相应生药质量浓度相同，把pH 值调为中性，用4℃冰箱保存备用。

3.2 干预治疗

①模型组：按照以上方法造模成功后，恢复正常喂养，不进行其它干预处理。

②实验各拆方组：以临床等效剂量换算至豚鼠用药量，1～3 号拆方组按照 10mg/kg，从 AR 造模 8d起施以灌胃治疗,各拆方组水煎液的具体用量如下：1 号拆方组：麻黄、附子、细辛，1.97g/KG；2 号拆方组：麻黄、附子，1.41g/KG；3 号拆方组：麻黄、细辛，1.12g/KG）每日灌胃用药一次,连续应用15d。

③地塞米松对照组：从AR 造模8d 起按照2mg/kg 给予地塞米松灌胃，每日灌胃用药一次,连续应用15d。

4 豚鼠行为观察及指标检测

4.1 豚鼠模型行为学变化

4.1.1 肺气虚寒模型豚鼠的行为学：观察其症状表现：①气短喘促；②咳嗽；③痰白清稀（口鼻四周分泌物）；④畏寒恶风（蜷缩抱团）；⑤毛发枯松没有光泽；⑥神疲乏力（反应迟钝，活动减少）。记录呼吸、脉搏、肛温、尿量等定量指标情况。

4.1.2 模型AR 疾病行为学：观察豚鼠抓鼻、打喷嚏、流清涕等变应性鼻炎发作时的症状。记录最后一次用药30min 内症状评分，见表1。

表1 AR 症状记分

4.2 造模相关指标检测

虚寒证候指标：血清皮质醇(F)、尿17-OHCS 等定量指标。

4.3 豚鼠鼻黏膜组织GATA-3mRNA 表达水平的半定量检测

采用RT-PCR 方法测定GATA-3mRNA 的表达水平。TRIzol 法抽提鼻黏膜总RNA，经纯化、浓度测定后，逆转录合成cDNA，以此模板行PCR 扩增，目的基因的引物序列：GATA -3 为上游 5’-TACCCTCCAGCCTCATCTTC -3’， 退 火 温 度 为59.24℃，下游 5’-TCACACACTCCCTGCCTTCT-3’，退 火 温 度 为 60.86℃ ，β -actin 上 游 5’-Tgc gTTACACCCTTTCTTgA-3’，退火温度 55.8℃，下游5’-gTCACCTTCACCgTTCCAgT -3’， 退 火 温 度59.8℃，将PCR Array 置于设置好的实时定量PCR仪上进行PCR 反应。采用2-△△CT 方法进行结果分析。

4.4 用Western 蛋白印迹法检测鼻黏膜组织中GATA-3 蛋白质表达。

100mg 冷冻鼻黏膜组织中加入600ul 裂解液，冰上匀浆、超声、静置1h，4℃离心（150000r/min）15min，取上清液，用BCA 法测定蛋白质浓度，将50ug 蛋白加入等体积的上样缓冲液，以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至硝酸纤维膜上；分别于GATA-3 和β-actin 单克隆抗体4℃过夜，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG 抗体室温孵育2h，ECL 发光试剂盒显示蛋白条带，数码曝光分析图片。

结果

1 麻黄附子细辛汤及其拆方对豚鼠肺气虚寒证候、AR 行为学指标的影响，见表2-4。

表2 实验用药后豚鼠虚寒症、AR 行为学P 值

在造模过程中，五组豚鼠均出现喜蜷缩抱团，活动减少，食量减退，咳嗽及鼻周分泌物增多、鼻黏膜颜色潮红，毛发枯槁成缕，体重增长缓慢甚至不增长。经不同拆方组药物干预后，麻附辛组、麻辛组、麻附组、地塞米松组虚寒症相关指标同干预前均有不同程度的改善，模型组与治疗前比较无显著性差异（P＞0.05）。在AR 行为学计分中，治疗后各组对比，麻附辛组与地塞米松组的差异无显著性（P＞0.05）而与其他组有差异（P＜0.05）。麻附组与麻辛组差异无显著性（P＞0.05）。

表3 实验用药前后豚鼠尿17- 羟皮质醇（0HCS-17）P 值

实验后，各配伍拆方组豚鼠OHCS-17 较造模后表达增强，并与模型组具有显著性差异（P＜0.05）。其中麻附辛组、麻附组、地塞米松组高表达，与其余组差异具有显著性（P＜0.05）。实验后，各拆方组血清皮质酮（F）较造模后表达增强（P＜0.05），并与模型组差异具有显著性（P＜0.05）。其中，麻附辛组、麻附组、麻辛组、地塞米松组血清皮质酮（F）高表达，与其余组差异具有显著性（P＜0.05）。

2 豚鼠鼻黏膜组织GATA-3mRNA 表达水平测定

GATA-3mRNA 表达情况，麻附辛组与地塞米松组差异无显著性（P＞0.05），与其他组差异具有显著性（P＜0.05）。麻附组、麻辛组、模型组三组差异无显著性（P＞0.05），见表 4、图 1。

表4 实验用药前后豚鼠血清皮质醇（F）P 值

表5 各组GATA-3 mRNA 相对表达量

图1 GATA-3 mRNA 相对表达量

3 豚鼠鼻黏膜组织GATA-3 蛋白质表达水平的测定

GATA-3 蛋白在各组豚鼠鼻黏膜中的表达结果如下：麻黄附子细辛组（0.31±0.04），麻黄附子组（0.56±0.06），麻黄细辛组（0.48±0.05），模型组（0.78±0.06），地塞米松组（0.49±0.04），以上数据来自不同实验次数（见图2）。

图2 GATA-3 在各实验组中的表达

讨论

麻黄附子细辛汤出自《伤寒论》，该方为治疗阳虚外感，太阳与少阴二经合病的经典方剂，其基本病机是，患者素体少阴真阳不足，肾水失于温煦，金水无以相生，虚寒内伏于肺，又遇太阳外感风寒表证，卫阳受郁，病邪不得发散，从太阳直走少阴而合病[11，12]。近几年，临床上越来越多的将其应用于治疗哮喘等变态反应方面的疾病。仝小林院士以“态靶因果”为指导，应用麻黄附子细辛汤加鹅不食草等治疗风寒湿型AR 取得较好临床效果[13]。我们前期临床中以麻黄附子细辛汤加味治疗肺气虚寒型变应性鼻炎获得了显著的疗效。通过麻黄附子细辛汤的药效有效成分分析，发现其能改善豚鼠变应性鼻炎的症状，与小青龙汤相比可明显降低豚鼠体内组胺水平[14]。通过分析麻黄附子细辛汤的分子成分及治疗变应性鼻炎的分子机制，发现麻黄附子细辛汤能修复受损鼻黏膜，减少炎症浸润，其通过作用于多条炎症、免疫通路[15]，起到抗炎、免疫抑制的作用。

变应性鼻炎的免疫机制极为复杂，涉及多种炎症细胞、细胞因子及信号传导通路。其中以Th1 作用减弱Th2 应答增强最为经典[16]。

GATA-3 是一种分子量为30000 的蛋白质，作为Th2 细胞分化的特异性转录因子[17]，其主要表达于淋巴细胞，T-bet/GATA-3 表达失衡是气道高反应性疾病发病的重要条件。GATA-3 和T-bet 在Th 细胞的分化调控中起关键作用，T-bet 主要在Thl 细胞中表达，可影响Thl 细胞的发育和IFN-γ 的分泌[18]。Th2型细胞因子IL-4 与其受体结合后，可激活JAK1/JAK3，其磷酸化又可促使IL-4 受体亚基发生磷酸化，从而激活STAT-6，启动转录因子GATA3。GATA3 的表达又可促进Th0 向Th2 细胞进行分化，产生 IL-4 等 Th2 细胞因子，形成正反馈调节[19，20]。

本课题显示，麻黄附子细辛组的GATA-3 蛋白质表达明显降低，麻黄附子细辛组及麻附组、麻辛组均能不同程度的调节豚鼠AR 的Th1/Th2 上游因子GATA-3 蛋白质的表达，对Th1/Th2 细胞失衡有调节作用。麻黄附子细辛汤整方作用更加突出，统计学分析与麻附组等另外四组差异具有显著性（P＜0.05），由此显示，麻黄附子细辛汤通过对GATA-3蛋白质表达的调控，特异性的调控Th2 细胞的表达，从而纠正了Th1/Th2 的细胞失调，从细胞因子分子水平验证了麻黄附子细辛汤组方配伍的合理性。