陈艳春 梅显伟 徐世影 王干 陈志凌

变应性鼻炎（allergic rhinitis, AR）又称为过敏性鼻炎，是由于机体接触变应原后，导致了IgE 介导的炎性因子释放，引起鼻黏膜非感染性炎性疾病[1]。其基本病理变化为局部毛细血管扩张、通透性增加、腺体分泌增加以及嗜酸性粒细胞浸润等[2，3]。AR 发病机制较复杂，微小 RNAs（micro-RNAs, miRNAs）参与了许多疾病发生发展[4]。先有报道证实了miRNAs通过细胞因子分泌、炎症细胞浸润、气道高反应性、平滑肌细胞增生和表型变化等方式参与了气道变应性疾病[5，6]，提示研究 miRNAs 与 AR 的关系可能有助于更好地理解AR 发病机制。在一项对AR 患者鼻黏膜上皮基因表达分析中，发现许多miRNA的表达在AR 中被改变，差异表达的miRNA 似乎参与了AR 的发展[7]。冯娟等[8]比较了AR 患者与非AR患者鼻腔黏膜组织中的miRNAs，发现miR-223-3p在两组患者间差异表达。目前对AR 患者鼻黏膜组织的miR-223 表达水平与疾病患病风险和严重程度关系鲜有报道。因此，本研究通过检测AR 患者鼻腔黏膜组织中miR-223 表达情况，分析miR-223 对AR 的诊断价值，miR-223 与AR 患病的严重程度及炎症因子水平的相关性，旨在揭示组织miR-223 表达在AR 疾病发生发展中作用。

资料与方法

1 临床资料

选取2019 年1 月～2020 年12 月我院耳鼻喉科收治的AR 合并鼻中隔偏曲患者35 例作为AR 组，年龄 22～37 岁，平均年龄（28.71±2.92）岁，男 18 例，女17 例。纳入标准：符合AR 诊断标准[9]；年龄＞18岁；均行手术治疗且手术前2 周内未曾使用过激素类药物、抗生素及抗组胺类药物；可同意配合获取鼻黏膜组织。排除标准：合并哮喘发作；多种因素引起的鼻腔堵塞，包括严重慢性鼻窦炎、鼻息肉及鼻腔鼻窦肿瘤等；患其他严重感染性疾病；合并恶性肿瘤者。同期选择非AR 的鼻中隔偏曲患者35 例作为对照组，年龄 22～40 岁，平均（30.06±4.74）岁，男18 例，女17 例。本研究获得我院医学伦理委员会的批准，参与者均签署了知情同意书。两组患者的一般资料进行比较差异无统计学意义，具有可比性。

2 样本收集

两组患者均在全麻下，进行鼻内镜下鼻中隔偏曲矫正手术，手术过程中切取部分下鼻甲后端黏膜组织（约3mm×3mm），取得组织后立刻用生理盐水进行冲洗处理，将冲洗后的组织放置于盛有RNAlater 液的试管中，-20℃冷冻处理，待检。

主要试剂

本研究采用的主要试剂包括了总RNA 提取试剂盒、荧光定量PCR 试剂、反转录试剂盒，miR-223、内参基因U6 引物，前三者均购于赛默飞世尔科技公司，后两者由上海捷瑞生物工程有限公司合成，见表1。

表1 引物信息

2.1 鼻黏膜组织miR-223 检测

①总RNA 提取：严格按照总RNA 提取试剂盒说明书提取样本组织的总RNA，提取RNA 后进行紫外分光光度计检验，选择A260/A280 为1.9～2.0的RNA 样品，RNA 的完整性用凝胶电泳检测RNA的完整性。②反转录cDNA：按照相关说明书进行操作，进行cDNA 的合成。反转录体系：5μl 的2×miRNA 反应混合液、1μl 的 0.1%牛血清白蛋白、1μl的 miRNA PrimeScript RT 酶 混合物、0.5μl 的总RNA、2.5μl 的去 RNA 酶 ddH2O，共 10μl。反应条件：37℃ 60min，85℃ 5s，4℃ 30min。③PCR 扩增:PCR 反应体系：5μl 的 SYBR R remix Ex TaqTMII（2×Conc.）、0.4μl 的上游引物、0.4μl 下游引物、0.2μl 的ROX Reference DyeⅡ（50×Conc.）、1μl 的 cDNA、3μl的 ddH2O，共 10μl。PCR 反应条件：50℃ 5min、95℃30s、95℃ 5s、60℃ 34s，反应进行 40 个循环。每个样孔设置 3 个复孔，取平均 Ct 值进行分析。2-ΔΔCt为相对表达水平。

2.2 炎症因子检测

术前采集患者静脉外周血5ml，2500rab/min 离心10min，离心完成后取上清液，采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测血清中的 TNF-α、IL-6 和 IL-17 表达水平。

3 观察指标

①鼻黏膜组织的miR-223 表达水平。②变应性鼻炎严重程度：采用单个鼻部症状评分（INSS）和总鼻部症状评分（TNSS）评估 AR 的严重程度，INSS 为患者自评，针对鼻部症状进行评分，分别包括流涕、鼻痒、喷嚏及鼻塞共4 种。每种症状的评分标准为：0 分表示无症状；1 分表示轻度症状；2 分表示中度症状；3 分表示重度症状，评分越高表明鼻部症状情况越严重。上述4 种症状的单个鼻部症状评分之和即为总鼻部症状评分（TNSS）[10]。③两组患者的TNF-α、IL-6 和 IL-17 水平。

4 统计学方法

采用SPSS 23.0 进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；非正态分布数据采用秩和检验，计数资料以频数(率)表示，组间比较采用χ2检验。采用ROC 曲线分析miR-223 相对表达量对AR 的诊断价值。相关性分析采用Pearson 相关性分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 鼻黏膜组织的miR-223 表达水平对AR 的诊断价值

1.1 两组患者鼻黏膜组织的miR-223 表达水平比较

AR 组鼻黏膜组织的miR-223 相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义，P＜0.05，见表2。

表2 两组患者鼻黏膜组织的miR-223 表达水平比较

1.2 鼻黏膜组织的miR-223 相对表达量诊断AR 的ROC 曲线分析

根据ROC 曲线分析结果显示，鼻黏膜组织的miR-223 相对表达量诊断AR 的曲线下面积为0.810，截断值为1.56，灵敏度为83.34%，特异度为78.26%，见图 1。

图1 鼻黏膜组织的miR-223 相对表达量诊断AR 的ROC 曲线

2 AR 患者的INSS 和TNSS 评分情况及其鼻黏膜组织的miR-223 表达水平的联系

AR 患者 INSS 评分中的流涕为（2.32±0.54）分、鼻痒为（2.16±0.63）分、喷嚏为（2.08±0.42）分、鼻塞为（1.87±0.39）分、TNSS 得分为（8.43±2.15）分。其中AR 患者鼻黏膜组织的miR-223 相对表达量与鼻痒评分、喷嚏评分、鼻塞评分和TNSS 均呈正相关（P＜0.05），与流涕评分呈负相关（P＜0.05），见表 3。

表3 miR-223 表达水平与AR 患病严重程度的相关性

3 鼻黏膜组织的miR-223 表达水平与炎症因子的联系

3.1 两组患者的 TNF-α、IL-6 和 IL-17 水平比较

结果显示，AR 组患者的 TNF-α、IL-6 和 IL-17水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 4。

表4 两组患者的TNF-α、IL-6 和IL-17 水平比较

3.2 鼻黏膜组织的miR-223 表达水平与AR 患者炎症因子的相关性

相关性分析结果显示，鼻黏膜组织的miR-223表达水平与AR 患者炎症因子TNF-α、IL-6 和IL-17 均呈正相关（P＜0.05），见表 5。

表5 鼻黏膜组织的miR-223 表达水平与AR 患者炎症因子的相关性

讨论

miRNA 是一类长度约为22 个核苷酸的非编码RNA 小分子，主要通过细胞核内转录，合成后进入细胞质，从而调控目标基因表达[11]，在诸多疾病发生发展过程扮演着重要作用[12，13]。近年来研究发现miR-223 在细胞分化过程中的表达有很大的变化，在破骨细胞、巨核细胞和EOS 分化过程中表达增加，在红细胞和巨噬细胞分化过程中表达减少[14]。miR-223 在多种炎症性疾病中被解除管制，例如，其在类风湿关节炎患者的外周血T 淋巴细胞和滑膜中过表达[15，16]，在骨关节炎患者的外周血单核细胞中过表达[17]，在炎性肠病（IBD）患者的结肠黏膜中过表达[18]等。因此研究miR-223 与炎症性疾病的关系，对炎症性疾病的诊断及治疗具有重要意义。近年来miRNA 与AR 的关系也越来越受到研究人员的关注[19]，但miR-223 在AR 患者中的研究鲜有报道，因此本文检测了AR 患者鼻黏膜组织的miR-223，并研究其与AR 患病风险、严重程度及炎症因子水平的联系，为AR 的治疗提供指导。

本研究结果显示，AR 组鼻黏膜组织的miR-223 相对表达量显著高于对照组（P＜0.05），且鼻黏膜组织的miR-223 诊断AR 灵敏度为83.34%，特异度为78.26%。提示miR-223 在AR 患者鼻黏膜中过表达，其可能参与了AR 的发生和发展，且在一定程度上可诊断AR 的发生。研究中还发现AR 患者鼻黏膜组织中TNF-α、IL-6 和IL-17 水平高于对照组患者，分析其原因，AR 患者的鼻黏膜组织中包含大量的肥大细胞、巨噬细胞等免疫效应细胞，可产生并分泌TNF-α、IL-6 和IL-17 等炎症因子，可参与机体的免疫调节，当机体在正常状态时，会严格调控这类细胞因子的表达以及分泌，但是在AR 的病理状态下，这类细胞因子由于出现自身及其相应受体缺陷情况，就会导致其异常表达的发生，这类细胞因子过高表达或者过低表达均可引起变态反应性疾病的发生。而本研究Pearson 相关分析显示，miR-223 表达量与 TNF-α、IL-6 和 IL-17 水平呈显著的正相关，P＜0.05，提示miR-223 的表达水平与TNF-α、IL-6 和 IL-17 水平密切相关，认为 miR-223的表达水平越高，TNF-α、IL-6 和 IL-17 的水平就越高，越容易引起变应性鼻炎。miR-223 属于较为常见的一种miRNA，人体多种细胞和组织中均存在，可参与炎症反应等过程。AR 患者的miR-223 表达水平与AR 患病严重程度呈正相关，表明miR-223表达水平与AR 患病的严重程度具有较大的相关性，研究发现[20]，AR 患者的鼻腔黏膜内炎症小体活化情况显著增强，认为miR-223 可能通过促进NLRP3 炎症小体的活化从而介导炎症因子的分泌，AR 患者鼻黏膜组织的miR-223 表达水平越高，炎症因子的表达水平就越高，其病情就越严重，也进一步提示miR-223 的表达情况可作为AR 患病严重程度的预测指标。

综上所述，miR-223 在AR 患者鼻黏膜组织中异常高表达，对AR 具备一定的诊断价值；鼻黏膜组织中的miR-223 相对表达水平与AR 患病严重程度和炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-17 水平均呈正相关，其有望作为分析AR 发病机制及疾病进展的关键指标。