刘 红， 刘贵莲， 袁 敏， 梅绍锋*， 耿维军， 朱九堡

（1.四川特驱农牧科技集团有限公司，四川成都610207；2.四川特驱投资集团有限公司，四川成都610207；3.新津邦得科技有限公司，四川成都611435）

斑蝥黄（或称斑蝥黄质）是一种类胡萝卜素，存在于某些蘑菇、甲壳类、鱼类、藻类、蛋、血液和肝脏中，1984年FDA/WHO批准斑蝥黄列入食品添加剂并制订了质量标准。斑蝥黄质可作为食品添加剂用于饮料、调味酱和肉类加工品等，另外，还可作为饲料添加剂改善蛋黄的颜色，并且着色后色调不受pH影响，对日光亦相当稳定，不易褪色。但斑蝥黄自身稳定性较差，对氧化剂、热和湿都十分敏感，因此需贮存于充惰性气体的遮光性容器内。GB/T 18970-2003检测方法中用无色的圆底烧瓶便于观察溶液的蒸发情况，存在色素降解的风险；用旋转蒸发仪蒸干5 mL样品需要1～2 h，同时旋转蒸发仪使用步骤繁锁，操作难度大；将蒸干的样品转入容量也增加了检测误差。因此本实验旨在对GB/T 18970-2003检测斑蝥黄方法进行改进，以提高检测效率和准确度。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂Secure225D-1CN分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）；TDZ4-WS台式低速离心机，湖南湘仪；UV-2800A紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）；MTN-2800D-24氮吹仪（无水浴控温），天津奥特赛恩斯；RE52CS-2旋转蒸发器，上海亚荣生化；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴锅，北京中兴伟业。无水乙醇、三氯甲烷、环己烷均为分析纯。

1.2 实验方法 本实验进行了4个单因子的改进：（1）溶液未吹干对检测结果的影响；（2）溶液刚吹干和容量瓶底白吹对检测结果的影响；（3）超声溶解时间对检测结果的影响；（4）自溶时间对检测结果的影响。最后通过分析检测结果，确认方法改进的关键因素。其他操作步骤按国标改进的测定方法进行。

1.2.1 样品的制备 取有代表性的样品约500 g，混合均匀，四分法将试样分装到4个避光真空的密封袋中，防止样品成分变质。

1.2.2 样品溶液的制备 称取试样0.10～0.11 g（即为10%天丽红或10%斑蝥黄；2.5%的斑蝥黄应称取0.35～0.40 g），精确到0.0001 g，置于250 mL容量瓶中，加10 mL预热至60℃的蒸馏水，并在60℃的水浴中保持5 min，冷却后，加100 mL无水乙醇和100 mL三氯甲烷，用超声波水浴处理5 min，用三氯甲烷定容。摇匀后，取出100 mL溶液置于两只50 mL具塞离心管内，4000 r/min离心5 min，移出离心上层清液待用。

1.2.3 国标检测步骤 移取离心管内上层清液5.0 mL，置于旋转蒸发器的圆底烧瓶中，在45℃真空蒸发至干，残渣用0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，加入环己烷，少量多次进行溶解，并转移到100 mL的容量瓶中，用环己烷定容。其检测数据为X1。

分光光度计测定波长是468～472 nm的吸收最大值，使用1 cm的吸收池，以空白环已烷作为参比。此方法提取的主要成分是β，β-胡萝卜-4，4-二酮，其在波长470 nm处有最大吸收值，在900～1100 nm有一个试剂杂峰。

1.3 数据统计与分析 实验数据用“平均值±标准偏差”表示，使用F检测法比较两个方法数据的精密度，用t检测比较两种方法的平均值之间是否存在显著性差异，同时国标GB/T 18970-2003重复性要求相对偏差应在2%以内。

2 结果

2.1 修改方法中几个关键因素的实验比对

2.1.1 上清液氮吹未吹干对样品检测含量的影响移取样品溶液制备中离心上层清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹仪（不需水浴控温）吹至容量瓶中液体0.5 mL左右，然后向容量瓶中加入0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，超声波中超声10 min，用环己烷定容。因为定容后溶液均浑浊，因此放置30 min变澄清后再进行比色。其检测数据为X2。

从表1可以看出，上清液未吹干，定容放置半小时后，溶液变澄清后检测吸光值，上清液使溶液的透光率降低，吸光值增大，使检测数据偏高，两个样品的相对偏差分别是4.58%、3.95%，均大于重复性要求的相对偏差2%，因此差异显著。

表1 上清液氮吹未吹干对样品检测含量的影响

2.1.2 上清液氮吹干燥程度对样品检测含量的影响 移取样品溶液制备中离心上层清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹仪（不需水浴控温）吹干或容量瓶底部吹白，残渣用0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，超声波中超声10 min，用环己烷定容。刚吹干的检测数据为X2，容量瓶底部吹白的检测数据为X3。

从表2可以看出，样品刚吹干或容量瓶底部变白，加0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，超声10 min定容比色，其相对偏差＜2%；F检测值为1.30，查表F表为3.79，F小于F表，X2与X3的精密度无显著性差异；10%天丽红和10%斑蝥黄的t检测值分别为0.13和0.09，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2与X3的准确度无显著性差异。

2.1.3 上清液氮吹干变白后超声溶解时间对样品检测含量的影响 移取样品溶液制备中离心上层清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹仪（不需水浴控温）吹至容量瓶底部变白，残渣用0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，超声波中超声10 min或20 min，用环己烷定容。超声10 min的检测数据为X2，超声20 min的检测数据为X3。

从表3可以看出，样品氮吹干后变白，加0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，水浴超声10 min定容比色或水浴超声20 min定容比色，其相对偏差＜2%；F检测值为2.73，查表F表为3.79，F小于F表，X2与X3的 精密度无显 著性差异；10%天丽红和10%斑蝥黄的t检测值分别为0.31和0.57，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2与X3的准确度无显著性差异。

表3 上清液氮吹干变白后超声溶解时间对样品检测含量的影响

2.1.4 上清液氮吹干变白后静止溶解时间对样品检测含量的影响 移取样品溶液制备中离心上层清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹仪（不需水浴控温）吹至容量瓶底部变白，残渣用0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，静止溶解20 min或45 min，用环己烷定容。静止溶解20 min的检测数据为X2，静止溶解45 min的检测数据为X3。

从表4可以看出，样品氮吹干后变白，加0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，静止溶解20 min定容比色或静止溶解45 min定容比色，其相对偏差＜2%；F检测值为1.34，查表F表为3.79，F小于F表，X2与X3的精密度无显著性差异；10%天丽红和10%斑蝥黄的t检测值分别为0.19和0.51，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2与X3的准确度无显著性差异。

表4 上清液氮吹干变白后静止溶解时间对样品检测含量的影响

2.2 国标GB/T18970-2003与改进后测定数据的分析 移取样品溶液制备中离心上层清液5.0 mL，置于旋转蒸发器的圆底烧瓶中，按国家标准：GB/T 18970-2003检测，检测数据为X1。

方法优化1：移取样品溶液制备中离心上层清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹仪（不需水浴控温）吹至无溶液，残渣用0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，水浴超声溶解10 min，用环己烷定容，检测数据为X2。

方法优化2：移取样品溶液制备中离心上层清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹仪（不需水浴控温）吹至无溶液，残渣用0.5 mL无水乙醇和0.5 mL三氯甲烷润湿后，静止溶解20 min，用环己烷定容，检测数据为X3。

从表5可以看出，优化方法1和优化方法2与国标的比对，其F检测值分别为1.80、1.12，查表F表为3.44，F均小于F表，两种优化方法与国标的精密度无显著性差异；2.5%斑蝥黄、10%天丽红、10%斑蝥黄的优化方法1和优化方法2的t检测值分别为1.31、0.79、0.25和2.43、0.62、0.58，查表（95%）得：t表=2.78，t小于t表，两种优化方法与国标的准确度无显著性差异。

表5 国家标准检测数据与优化方法的数据比对

3 讨论

现行国家标准：GB/T 18970-2003饲料添加剂10%β，β-胡萝卜-4，4-二酮（10%斑蝥黄），使用的旋转蒸发仪，其真空度控制的难度较大，操作过程繁琐；使用的蒸发瓶为无色，存在色素降解的风险，因为斑蝥黄对氧气、光和热都十分敏感；同时还多了蒸干后溶解转移的步骤，增加了操作的难度。改进后的方法，直接将5 mL的上清液移到100 mL的棕色容量瓶中（棕色容量瓶有避光的作用），通过氮吹的方式，只需1 h左右就可以吹干，且一次可进行三个样品氮吹，移取氮吹的上清液，吹干或吹干变白也不影响检测结果。因为在氮吹时，可能出现刚好吹干或吹白情况，因此将静止溶解的时间定为20 min或超声溶解的时间定为10 min。两种优化方法有助于提高检测的精密度和准确性，同时节约了检测时间。