王崇 王连军 杨新笋 雷剑 柴沙沙 张文英 焦春海 田小海

摘  要：基于甘薯叶绿体基因组，利用cpSSR分子标记，对104份甘薯栽培品种和地方品种进行遗传多样性分析并构建指纹图谱，为甘薯资源的保护鉴定和遗传改良提供参考。使用了11对cpSSR引物，在104个甘薯材料中总共扩增得到58条条带，多态性条带为47条，单条引物平均扩增的条带数为5.27，平均多态性百分率为81.03%。根据引物在甘薯材料中的扩增结果，构建104个甘薯品种的指纹图谱。对104个甘薯品种的扩增结果进行聚类分析，每个品种间的遗传距离为0.0386～5.2723，平均遗传距离为0.2201，在遗传系数为0.74时将104个甘薯品种分为5组。

关键词：甘薯;cpSSR分子标记;遗传多样性;指纹图谱

中图分类号：S531      文献标识码：A

Construction of cpSSR Fingerprints and Genetic Diversity Analysis of 104 Sweetpotato Varieties

WANG Chong1， 2， WANG Lianjun1*， YANG Xinsun1， LEI Jian1， CHAI Shasha1， ZHANG Wenying2， JIAO Chunhai3**， TIAN Xiaohai2*

1. Hubei Key Laboratory of Food Crops Germplasm and Genetic Improvement  /  Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences / Hubei Sweetpotato Engineering and Technology Research Centre， Wuhan， Hubei 430064， China; 2. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025， China; 3. Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064， China

Abstract： Based on the sweetpotato chloroplast genome， this study developed cpSSR molecular markers and analyzed the genetic diversity of 104 cultivars and landraces sweetpotato. A fingerprint map was constructed to provide references for the protection identification and genetic improvement of sweet potato resources. 11 pairs of cpSSR markers were used in this study. A total of 58 bands were amplified from 104 sweetpotato materials， with 47 polymorphic bands. The average number of bands amplified by a single primer was 5.27， and the average polymorphism percentage was 81.03%. Based on the amplification results of the primers in the sweet potato material， the fingerprints of 104 sweet potato varieties were constructed. Cluster analysis was performed on the amplification results of 104 sweetpotato varieties. The genetic distance between each variety was 0.0386 to 5.2723， and the average genetic distance was 0.2201. When the genetic coefficient was 0.74， the 104 sweet potato varieties were divided into 5 groups.

Keywords： sweetpotato; cpSSR marker; genetic diversity; fingerprinting

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.006

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam]是雙子叶植物，属旋花科（Convolvulaceae）番薯属（Ipomoea Linn.），是重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物，是世界第七大粮食作物，中国第四大粮食作物[1]。全球甘薯种植面积和产量分别为832.79万hm2和1.064亿t，中国甘薯种植面积为337.28万hm2，产量0.85亿t，分别占全球甘薯种植面积和产量的40.5%与67.0%，均居世界首位[2]。甘薯是同源六倍体植物，染色体数目多，遗传信息复杂，给甘薯的遗传改良和亲本选配带来了一定的困难[3]。

分子标记技术是作物育种的一种重要手段，Selaocoe等[4]使用RAPD标记对31份在南非种植的甘薯品种进行分析，为甘薯的营养改良和抗逆育种提供了参考;苏文瑾等[5]利用SLAP-seq技术，以300份甘薯资源为材料，开发出795 794个SNP位点，为SNP在甘薯资源的鉴定、高遗传图谱的构建和重要性状关联分析奠定了基础;Zhao等[6]通过AFLP标记和SSR分子标记，对‘徐薯18和‘徐781的F1分离群体202个株系构建双亲连锁图谱，得到父母本的90个连锁群。分子标记技术还被应用于构建植物的指纹图谱，通过构建植物DNA指纹图谱可有效鉴定植物品种的真实性，在水稻、马玲薯、棉花等作物中的品种保护上起到重要作用[7-9]。如胡文舜等[10]利用SSR标记技术构建了19个枇杷杂交品种的指纹图谱，验证了分子标记指纹图谱在区分杂交品种上的可行性;聂立园等[11]基于SSR标记，采用筛选核心引物的方法，构建了132份甘薯种质的指纹图谱，可对甘薯品种进行有效区分;王崇等[12]利用cpSSR标记，对16份甘薯品种进行遗传多样性分析和指纹图谱的构建，显示品种间遗传多样性丰富，构建的甘薯指纹图谱可用于品种鉴定。综上所述，结合分子标记技术构建甘薯指纹图谱，可为甘薯新品种保护和资源鉴定提供新的指导。

叶绿体微卫星（chloroplast simple sequence repeat，cpSSR）标记是基于植物叶绿体基因组开发的一种分子标记，兼具普通SSR标记和叶绿体基因组的特点。具有引物多态性高、重复性好、分布广、数量丰富等优点，又兼顾cpDNA序列保守、进化缓慢、结构简单、单亲遗传等特点[13]，cpDNA中大多数编码蛋白基因与光合作用和许多生化过程相关，如淀粉合成和氮代谢等，还可能参与植物的免疫反应[14-15];cpDNA中还包含许多保守区域，可为植物的系统分类和条形码（DNA binding）提供参考[16]。cpSSR分子标记技术在居群保护、植物种群结构分析、亲缘关系鉴定和系统发育的研究中被广泛应用[17]。Lee等[18]使用8对多态性好的cpSSR引物，对来自中国、日本、美国、韩国等10个国家的558个甘薯品种进行遗传多样性分析，结果表明甘薯的母本遗传多样性低;Saxena等[19]开发出17对cpSSR引物对7份不同树豆种质资源进行分析，结果表明cpSSR标记可有效鉴定树豆栽培种和野生种;Yan等[20]开发cpSSR标记，表明该标记可用于水松的种群遗传和地理结构分析。本研究采用cpSSR标记技术，对104个甘薯品种进行遗传多样性分析，并构建指纹图谱，旨在为甘薯品種的鉴定区分和优质品种保护提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

本试验包括104个不同品种的甘薯材料（表1），分别来自安徽、北京、重庆、四川、山东、湖北、湖南、江苏、河北、河南、江西、浙江、广东等地。2018年种植于湖北省农业科学院粮食作物研究所试验基地，2019年采取新鲜叶片进行试验。

1.2  方法

1.2.1  基因组DNA的提取及引物筛选  参考Kim等[21]的方法，采用改良CTAB法提取甘薯基因组DNA。将提取的DNA在1.0%的琼脂糖中进行电泳观察，检测DNA完整性;使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测量浓度和纯度。将本研究中所用DNA模板的浓度稀释到50～60 ng/μL，在–80 ℃的冰箱中保存，用于后续研究。参考王崇等[12]的cpSSR标记引物用于本研究，全部引物均委托武汉天一生物有限公司合成。

1.2.2  cpSSR扩增  PCR的反应体系为10×PAGE buffer（Mg2+）5 μL，dNTPs（10 mmol/L）4 μL，DNA（50～60 ng/μL）1 μL，Easy-Taq Polymerase（500 U/μL）0.5 μL，正向引物和反向引物各1 μL，加ddH2O补至总体积为50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸5 min，然后在4 ℃条件下保存5 min。扩增产物在0.5%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后银染显色，进行观察。

1.3  数据处理

人工记录聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，对于同一引物的扩增产物，选择大小合适、清晰明亮和分辨率高的条带，同一位置有条带的记为“1”，无条带或条带模糊的记为“0”，形成[0，1]的原始数据矩阵，输入Excel 2016中，把图形数据转换为数字数据。利用软件NTSYS-pc 2.1.0计算甘薯品种间的遗传距离[22]，利用软件MEGA 7.0.21的非加权平均数法进行聚类分析并生成甘薯品种的树状聚类图[23];采用王红意等[24]的方法构建甘薯品种的数字指纹图谱。

2  结果与分析

2.1  cpSSR多态性分析

用11对引物在104份甘薯材料基因组DNA中进行扩增，共扩增出58条条带，多态性条带为47条，平均多态性百分率为81.03%。每条引物平均扩增的条带数为5.27，每条引物平均扩增的多态性条带数为4.27。其中引物CPS18扩增得到的多态性条带最多，为6条;引物CPS14扩增获得的多态性条带最少，为1条（表2）。

2.2  聚类分析

使用11对引物将供试材料进行聚类分析，用软件NTSYS-pc 2.1.0计算得到104个甘薯品种间的遗传距离矩阵，每个甘薯品种间的遗传距离为0.0386～5.2723，平均遗传距离为0.2201，表明供试材料间的遗传多样性较为丰富。根据104个甘薯品种的遗传距离矩阵，利用软件MEGA 7.0.2的非加权平均数法进行聚类分析并生成104个甘薯品种的树状聚类图（图1）。从聚类树状图可以看出，在遗传系数为0.74时，可将104个甘薯品种分为5组。第1组包括‘阜紫薯1号和‘阜徐薯11号，2个品种的遗传距离为0.171，表明亲缘关系较近;第2组包括‘郑红21‘烟紫薯3号‘冀薯332等29个品种;第3组包括‘阜薯24‘阜徐薯20‘阜徐薯6号‘冀薯4号‘冀薯332‘冀薯99‘绵紫薯9号‘广紫薯8号等64个品种;第4组包括‘宁Y76-3‘鄂薯6号‘赣GZ12-27‘渝紫薯7号‘鄂紫薯13‘渝薯50‘红心王‘川紫薯4号等8个品种，其中‘赣GZ12-27与‘鄂紫薯13的遗传距离最大（0.2086），‘红心王与‘鄂紫薯13的遗传距离最小（0.0386），品种间的亲缘关系较近;第5组只有‘皖苏311个品种。

2.3  DNA指纹图谱构建

根据11对cpSSR引物的扩增结果对引物多样性进行分析，综合多方面的因素来构建甘薯品种的指纹图谱。本研究选择引物在每个品种对应的扩增结果作为参考指标，把扩增结果的有无构成一串以“0”和“1”组成的数字，每串数字表示1个甘薯品种的特征值，即为甘薯的“指纹图谱”，从而构建104个甘薯品种的指纹图谱（表3）。采用扩增结果较好的引物CPS4和CPS5来构建指纹图谱。

3  讨论

甘薯是无性繁殖作物，放任授粉（集团杂交）是甘薯育种主要方法之一[25]，而集团杂交与甘薯的细胞质遗传相关，表明基于叶绿体基因组开发的SSR标记在研究甘薯集团杂交后代上有一定的应用价值。

对104份普通甘薯的遗传多样性分析，结果显示其遗传多样性丰富，试验结果与Lee等[18]、Yang等[26]、赵冬兰等[27]的研究结果基本保持一致，群体间的遗传多样性与多态性含量是相符的，遗传多样性的丰富程度与群体的遗传背景相关，还与所设计的分子标记引物有关，本研究选用的cpSSR引物较少，可能与甘薯叶绿体基因组的特性有关，与核基因组相比，叶绿体基因组信息相对较少。采用分子标记进行遗传多样性分析，最终的结果可靠程度与标记引物的数量和质量密切相关。与王崇等[12]所采用的研究材料不同，品种数量不同，本研究所用的甘薯品种包括紫薯、淀粉型薯、鲜食型薯等类型的104个甘薯品种，遗传分析结果更加准确。遗传分析显示，品种聚类结果与品种类型和标记无直接联系，如‘商薯8号和‘苏薯35被聚类在一起，‘皖薯373和‘宁紫薯1号被聚类在一起。聚类分析显示，来自同一地区的品种被聚类在一起，如‘冀薯99和‘冀薯982，‘鄂紫薯13和‘鄂薯6号;具有相同亲本或血缘关系相近的品种被聚在一起，如‘冀薯332和‘冀薯4号，‘阜菜薯1號和‘烟紫薯3号，聚类结果与罗忠霞等[28]的研究结果基本保持一致。‘皖苏31被单独聚在一组，与预期设想一致，表明cpSSR标记能够较为准确地对甘薯品种进行聚类。cpSSR标记的聚类结果可在一定程度上反映甘薯的亲缘关系，可为甘薯育种中高效选择亲本提供参考，在育种亲本的选配时，宜优先考虑亲缘关系远、地理位置不同、遗传背景差异大的优良品种。

DNA指纹图谱具有高度的特异性、准确性和稳定性，能够在分子层面分辨某一群体中生物个体间的差异，可避免因外界条件造成的干扰，有效鉴定种质资源和选择育种亲本[29]。李航等[30]通过开发cpSSR标记和nSSR标记对21份不同柑橘种质资源进行分析，结果表明cpSSR和nSSR结合使用可以比较准确地鉴定柑橘杂种;Singh等[31]开发cpSSR标记，并将其应用于剑兰指纹图谱的构建;Roullier等[32]结合cpSSR和nSSR标记，对329份甘薯品种进行分析，为甘薯驯化源于南美洲提供了证据，表明通过结合cpSSR和nSSR标记可有效研究种质资源。分子标记开发指纹图谱是筛选不同植物品种的有效方法，指纹图谱的构建一般采用特征谱带法、引物组合法或核心引物组合法[33]。利用分子标记构建指纹图谱的原则是选用较少的引物，获得精确的鉴定结果。本研究选用的104个甘薯品种，主要来自江苏、河南、安徽和湖南等地，甘薯品种类型主要是紫薯、食用型等，在构建指纹图谱时，当选用引物CPS4和CPS5来构建104个甘薯品种的指纹图谱时，只能有效区分‘郑红21‘浙紫薯3号‘渝紫薯73‘苏薯16‘浙薯70‘万薯9号‘皖苏718‘皖苏61‘皖苏31和‘红心王等10个品种，表明cpSSR分子标记可用于细胞质遗传后代的研究，但是对具有相同或相似亲本的甘薯品种进行指纹图谱构建时，若要对甘薯品种进行更为准确有效地区分，可增加新引物或者结合nSSR等标记技术。

参考文献

[161]   马代夫， 李  强， 曹清河， 等. 中国甘薯产业及产业技术的发展与展望[J]. 江苏农业学报， 2012， 28（5）： 969-973.

[162]   刘洪明， 吕宝村， 王桂莲， 等. 我国甘薯专业合作社存在的问题与发展对策——基于即墨市固定观察点的调查与分析[J]. 安徽农业科学， 2020， 48（2）： 244-247.

[163]   Yang J， Moeinzadeh M H， Kuhl H， et al. Haplotype-resolved sweetpotato genome traces back its hexaploidization history[J]. Nature Plants， 2017， 3（18）： 696-703.

[164]   Selaocoe M E， Adebola P， Pillay M， et al. Genetic diversity of South African sweetpotato germplasm using molecular markers[J]. Journal of Crop Improvement， 2019， 33（6）： 814-833.

[165]   苏文瑾， 赵  宁， 雷  剑， 等. 基于SLAF-seq技术的甘薯SNP位点开发[J]. 中国农业科学， 2016， 49（1）： 27-47.

[166]   Zhao N， Yu X X， Jie Q， et al. A genetic linkage map based on AFLP and SSR markers and mapping of QTL for dry-matter content in sweetpotato[J]. Molecular Breeding， 2013， 32（4）： 807-820.

[167]   秦瑞英， 许  学， 张立平， 等. 小麦SSR指纹图谱及品种身份证的构建——基于毛细管电泳分析[J]. 中国农学通报， 2017， 33（34）： 46-55.

[168]   Duan Y F， Liu J， Xu J F， et al. DNA fingerprinting and genetic diversity analysis with simple sequence repeat markers of 217 potato cultivars （Solanum tuberosum L.） in China[J]. American Journal of Potato Research， 2019， 96（1）： 21-32.

[169]  李乐晨， 朱国忠， 苏秀娟， 等. 适于海岛棉指纹图谱构建的SNP核心位点筛选与评价[J]. 作物学报， 2019， 45（5）： 647-655.

[170]   胡文舜， 邓朝军， 许奇志， 等. 19个枇杷杂交新品种（系）的SSR鉴定和指纹图谱构建[J]. 热带亚热带植物学报， 2020， 28（2）： 153-162.

[171]   聂立圆， 李爱贤， 秦  桢， 等. 基于SSR标记的132份甘薯种质指纹图谱的构建及遗传多样性分析[J]. 植物遗传资源学报， 2018， 19（5）： 904-911.

[172]  王  崇， 王连军， 苏文瑾， 等. 基于cpSSR标记的甘薯品种亲缘关系及遗传多样性分析[J]. 分子植物育种， 2020， 18（5）： 1687-1696.

[173]   Yan L， Lai X J， Li X D， et al. Analyses of the complete genome and gene expression of chloroplast of sweetpotato [Ipomoea batata][J]. PLoS One， 2017， 10（4）： e124083.

[174]   Martin G， Baurens F C， Cardi C， et al. The complete chloroplast genome of banana （Musa acuminata， Zingiberales）： insight into plastid monocotyledon evolution[J]. PLoS One， 2018， 8（6）： e67350.

[175]   Ma J， Yang B X， Zhu W， et al. The complete chloroplast genome sequence of Mahonia bealei （Berberidaceae） reveals a significant expansion of the inverted repeat and phylogenetic relationship with other angiosperms[J]. Gene， 2013， 528（2）： 120-131.

[176]   Zhang Y， Li L， Yan T L， et al. Complete chloroplast genome sequences of Praxelis （Eupatorium catarium Veldkamp）， an important invasive species[J]. Gene， 2014， 549（1）： 58-69.

[177]   王化坤， 婁晓鸣， 章  镇. 叶绿体微卫星在植物种质资源研究中的应用[J]. 分子植物育种， 2006（S1）： 92-98.

[178]   Kyung Jun Lee， Gi-An Lee， Jung-Ro Lee， et al. Genetic diversity of sweetpotato （Ipomoea batatas L. Lam） germplasms collected worldwide using chloroplast SSR markers[J]. Agronomy， 2019， 9（11）： 752.

[179]   Saxena S， Kaila T， Chaduvula P K， et al. Novel chloroplast microsatellite markers in pigeonpea （Cajanus cajan L. Millsp.） and their transferability to wild Cajanus species[J]. Australian Journal of Crop Science， 2019， 13（2）： 185-191.

[180]   Yan Y D， Li X Y， Worth J R P， et al. Development of chloroplast microsatellite markers for Glyptostrobus pensilis （Cupressaceae）[J]. Applications in Plant Sciences， 2019， 7（7）： e11277.

[181]   Kim S， Hamada T. Rapid and reliable method of extracting DNA and RNA from sweetpotato， Ipomoea batatas （L）. Lam[J]. Biotechnology Letters， 2005， 27（23）： 1841-1845.

[182]   赖恭梯， 赖钟雄， 刘炜婳， 等. 福建中部3个野生蕉自然居群基于NTSYS和STRUCTURE软件的ISSR分析[J]. 热带作物学报， 2014， 35（2）： 223-231.

[183]   Kumar S， Nei M， Dudley J， et al. MEGA： A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences[J]. Briefings in Bioinformatics， 2008， 9（4）： 299-306.

[184]   王红意， 翟  紅， 王玉萍， 等. 30个中国甘薯主栽品种的RAPD指纹图谱构建及遗传变异分析[J]. 分子植物育种， 2009， 7（5）： 879-884.

[185]   王连军， 雷  剑， 苏文瑾， 等. 2005～2014年甘薯品种国家鉴定情况分析[J]. 湖北农业科学， 2015， 54（12）： 2844-2846， 2849.

[186]   Yang X S， Su W J， Wang L J， et al. Molecular diversity and genetic structure of 380 sweetpotato accessions as revealed by SSR markers[J]. Journal of Integrative Agriculture， 2015， 14（4）： 633-641.

[187]   赵冬兰， 唐  君， 曹清河， 等. 中国甘薯地方种质资源遗传多样性分析[J]. 植物遗传资源学报， 2015， 16（5）： 994-1003.

[188]   罗忠霞， 房伯平， 李  茹， 等. 基于EST-SSR标记的甘薯种质资源DNA指纹图谱构建[J]. 植物遗传资源学报， 2014， 15（4）： 810-814.

[189]   Chen Y N， Dai X G， Hou J， et al. DNA fingerprinting of oil camellia cultivars with SSR markers[J]. Tree Genetics and Genomes， 2016， 12（1）： 1-8.

[190]   李  航， 杨晓明， 丁德宽， 等. 基于cpSSR和nSSR标记的地方柑橘资源‘枳雀亲本分析[J]. 果树学报， 2018， 35（10）： 1161-1169.

[191]   Singh N， Pal K A， Roy R K， et al. Development of cpSSR markers for analysis of genetic diversity in Gladiolus cultivars[J]. Plant Gene， 2017， 10： 31-36.

[192]   Roullier C， Rossel G， Tay D， et al. Combining chloroplast and nuclear microsatellites to investigate origin and dispersal of New World sweetpotato landraces[J]. Mol Ecol， 2011， 20（19）： 3963-3977.

[193]   陈世军， 张明泽， 姚玉仙， 等. 基于SSR标记的黔南茶树种质资源DNA指纹图谱构建[J]. 植物遗传资源学报， 2017， 18（1）： 106-111.

责任编辑：沈德发