刘 洋，陈立军，靳秋月，袁建龙

（1.内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010050；2.武警后勤学院卫生勤务系）

pim基因属于丝氨酸/苏氨酸细胞蛋白激酶（proviral integration site of murine）家族，对凋亡诱导通道进行有效的控制不仅可有效阻止染色体异常细胞凋亡，而且还能够对细胞周期进行实时调控，一旦染色体分离会产生影响，导致失败，同时还会呈现出多倍性，此时也就会出现恶性肿瘤[1～3]。本实验通过STAT3-si RNA表达载体转染肝癌SMMC-7721细胞株，研究STAT3-siRNA表达载体对更有助于对STAT3信号转导通路进行研究，同时还便于分析下游pim-2基因的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

si LentGeneTM-2 U6 Hairpin Cloning System（Human）试剂盒在此次实验中我们所选定的供应商为Promega公司、购自NEB公司的限制性内切酶EcoRⅤ、购自博奥申公司的质粒提取试剂盒、总RNA提取试剂在此次实验中我们所选定的供应商为Invitrogen公司、RT-PCR试剂盒在此次实验中我们所选定供应商为索来宝公司、购自Promega公司的CodeBreakerTMsiRNA脂质体转染试剂、购自Santa Cruz公司的PIM-2单克隆抗体、购自博奥申公司的β-actin单克隆抗体、由大连宝生物公司合成的STAT3基因片段、由上海赛百盛公司合成的内参βactin引物和pim-2引物。

1.2 细胞培养

肝癌细胞株SMMC-7721放置在CO2培养箱内培养，5%CO2，37℃静置培养，培养基为含10%的小牛血清RPMI-1640。

1.3 化学合成si RNA

从Genebank获取人STAT3mRNA全序列（序列号：NM003150）。在RNA干扰设计原则的指导下，寻找干扰RNA的靶序列，该序列在对EST基因库进行检索时主要采用了BIast，这样就可以保证是独一无二的靶向基因，同时需要保证STAT3特异性的，对于其他基因的表达没有任何的抑制，同时该部位也没有任何的碱基多态性，1426-1444的核苷酸碱基序在此时也就可以确定TTGAATTCTGCAGAGAGGC，是RNA的干扰序列。……