张青杰，郑天歌，程 涛，贾靖仪，梁建辉

（北京大学药学院分子与细胞药理学系，北京 100083）

脑电图（electroencephalogram，EEG）是一种利用电生理信号记录仪检测得的表征大脑活动情况的图形［1］，可观察和分析脑细胞群自发性和节律性电活动的规律和特征。EEG不仅在临床神经精神疾病的诊断和治疗中得到广泛应用，而且是相关基础研究有效的实验方法和手段，在筛选和评价神经精神疾病治疗药物、研究其药理学作用机制等方面发挥重要作用［2-3］。目前清醒动物EEG采集方法分为有线和无线2种，前者通过电线连接动物头部植入的颅内电极采集动物脑电信号，后者则采用无线遥感技术［4-5］。无线采集法具有不干扰动物自由活动、可避免电线晃动对脑电信号的影响等优点，但成本高、植入头部的传输器大而重、技术要求高而难及操作复杂等缺点限制了其推广和应用，尤其不适合小鼠相关实验研究［4-5］。因此，在相关实验研究中，许多实验室仍然选择和使用有线法。

无论是有线还是无线采集法，颅内电极的埋置和电极连接装置或脑电信号传输器的安装都是必要的实验步骤。传统经典的电极埋置和安装属于裸露式，即颅内电极连接装置或脑电信号传输器直接埋置在大鼠或小鼠头顶部，裸露在头皮外。实际操作发现，裸露式颅内电极安装法在术后实验过程中，易出现电极连接装置脱落且不可修复，给后续实验带来难以克服的困难和损失。经过反复摸索和预实验，本课题组建立一种大鼠和小鼠颅内电极“头皮包埋式”埋置法，系统考察该方法采集脑电信号的可行性和有效性，以期在大鼠和小鼠脑电测定相关实验中推广应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性 SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重 220～270 g；雄性ICR小鼠，体重22～25 g；均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，合格证号：11001-11911054401；饲养环境温度22～23℃，湿度30%～50%，12/12 h明暗光照循环，自由进食进水。大鼠和小鼠分笼饲养，术前大鼠每笼5只（大笼），小鼠每笼5只（中笼），术后均单笼饲养。实验开始前，大鼠和小鼠须在动物房适应4 d以上，定时抓摸以消除应激反应。实验流程遵循美国国立卫生研究院实验动物维护和使用指南（No.80-23，1996）。

1.2 实验装置和相关材料

选用杜邦线（型号/规格为1007-24AWG，钦源盛电子）作为大鼠电极，PVC镀锡铜线（型号/规格为1571-28AWG，宏观盛电缆）为小鼠电极。电极插座：JST连接插座（型号/规格为1.25-6A），深圳市新融跃电子。颅钉〔平头螺丝，型号/规格为M1.4 mm×L2.5 mm（大鼠），型号/规格为M1.2 mm×L2.0 mm（小鼠）〕，深圳瑞沃德公司。义齿基托树脂（Ⅱ型）和树脂液剂（Ⅱ型），上海新世纪齿科材料有限公司；组织胶水（3M Vetbond Tissue），上海玉研科学仪器有限公司；大鼠和小鼠脑立体定位仪和颅骨钻，深圳瑞沃德公司。脑电信号采集系统：MP150多导生理信号记录仪和AcqKnowledge4.2采集软件，美国Biopac公司；SleepSign软件（版本：3.2.6.1404），日本Kissei Comtec公司。

1.3 大鼠和小鼠颅内电极埋置

1.3.1 颅内电极连接装置制作

“头皮包埋式”埋置法使用的颅内电极连接装置为自行设计制作，由电极连接导线和连接插座组成（图1A和1B）。6P JST1.25连接插座焊接3根直径1.0 mm（大鼠）或0.6 mm（小鼠）带绝缘漆皮的导线，线长2.5 cm（大鼠）或2.0 cm（小鼠），末端0.5 cm处剥落漆皮，使金属丝裸露可缠绕于颅钉上导电。焊接处用热熔胶涂抹做绝缘处理，最外部包裹一层热缩管，起加固和绝缘作用。

Fig.1 Electroencephalogram（EEG）electrode connection device used for collecting rat and mouse EEG signals.A：the self-designed electrode connection device for rats；B：the self-designed electrode connection device for mice；C：the electrode connection device used in the traditional uncovered method.

传统裸露式安装法所用EEG电极连接装置如图1C，3根裸露金属丝分别焊接在连接插座针脚上，金属丝长2～3 cm，直径约0.3 mm，外部无任何绝缘措施。

1.3.2 颅骨暴露手术

使用0.3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1，ip）麻醉大鼠和小鼠。翻正反射消失后，头颈部剃毛。按常规，脑立体定位仪固定大鼠或小鼠头部（手术台铺保温垫，避免体温下降）和消毒，并暴露头部骨窗。操作如下：①“头皮包埋式”埋置法：头部中线位置做纵行线性切口，大鼠切口长约1.2 cm，小鼠切口长约0.8 cm。3%H2O2溶液处理切口内的头皮下组织，暴露出前后囟。②传统裸露式电极安装法：头部剪去面积大小适当的皮肤组织（直径不低于前后囟位置长度的圆形），3%H2O2溶液处理裸露出来的头皮下组织。

1.3.3 颅内电极植入

安装坐标。大鼠：左侧枕叶（AP-4.80，ML-3.0），右侧枕叶（AP-4.80，ML+3.0），左侧皮质前额叶区（AP+2.0，ML-2.0）；小鼠：左侧枕叶（AP-2.5，ML-2.0），右侧枕叶（AP-2.5，ML+2.0），左侧皮质前额叶区（AP+1.0，ML-1.0）。

采用脑立体定位仪，按上述坐标在颅骨表面定位，标记，钻孔（直径约1.0 mm），垂直拧入颅钉（颅内电极），至大脑组织表面即可。随后安装EEG电极连接装置。①“头皮包埋式”埋置法：在颈背部距前囟位置3.0 cm（大鼠）或2.0 cm（小鼠）处作横向切口0.5 cm，分离皮下组织至头部切口。颅内电极连接装置经颈背部切口皮下插入，分别将3根电极连接导线与3枚颅钉相连，并将颅内电极连接装置的插座部分裸露在颈背部切口之外。碘伏消毒后，用适量牙托水泥包封颅钉和电极导线。牙托水泥固化后，切口消毒，涂抹组织胶水黏合头部切口和颈背部切口，即将颅钉和电极连接导线埋置皮下。②传统裸露式电极安装法：使用传统方法用电极连接装置，在大鼠或小鼠头部暴露的骨窗处，分别将裸露金属丝与颅钉缠绕连接。随后使用适量牙托水泥包封头部颅钉、电极连接装置的金属丝和插座针脚，头部其他创面亦需用牙托水泥覆盖。术后ip给予青霉素，预防切口感染。恢复7 d后进行EEG相关实验。

1.4 脑电图数据采集

动物适应实验环境1 h后，将MP150多导生理信号记录仪上的信号采集传输线与颅内电极连接装置的插座相连接，持续采集15 min。实验数据的采样频率设置为50 Hz，EEG100C脑电放大器的输入频带范围为0.1～1000 Hz。

1.5 数据分析和统计学分析

使用SleepSign软件（版本：3.2.6.1404）分析脑电信号的频率和功率。相对功率可消除不同个体脑电信号功率自身的差异对实验结果的影响［6］。相对功率（%）=（不同频率的功率/总功率）×100%。

2 结果

2.1 头皮组织切口愈合和颅内电极保持

采用“头皮包埋式”埋置法安装大鼠和小鼠头部脑电电极，术后7 d，大鼠和小鼠头部和颈背部切口基本愈合，未见感染，进食进水及一般行为活动未受明显影响，可进行脑电采集相关实验。图2A和2B显示，术后21 d，虽仍可见头部和颈背部切口裸露的皮肤，但整体恢复良好，未见组织坏死。术后42 d，切口完全修复，包埋颅内电极的头皮组织生长良好，新生毛发完全覆盖切口。尤其是颅内电极及其连接装置保持完好。而传统裸露式颅内电极安装法手术21和42 d后，切口仍然裸露，并出现不同程度的炎症和溃烂（图2C）。

Fig.2 Recoveries of incisions in rats and mice.A：rats treated with sub-scalp EEG electrode installation method；B：mice treated with sub-scalp EEG electrode installation method；C：rats treated with traditional uncovered method.

针对颅内电极和连接装置脱落的情况，本研究选取相同周龄的大鼠20只，随机分为2组，每组10只。分别采用“头皮包埋式”埋置法和传统裸露式安装法安装EEG电极连接装置，术后连续观察100 d。前者未见电极装置脱落，后者大鼠头部电极装置脱落3/10。同样方法检验小鼠EEG电极装置的脱落情况，连续观察100 d，前者无电极装置脱落，后者电极装置脱落2/10。

2.2 “头皮包埋式”埋置法可行性验证

为验证所建立的颅内电极“头皮包埋式”埋置法和传统裸露法脑电信号检测结果的一致性，比较和分析大鼠和小鼠在清醒和麻醉状态下的EEG相对功率。图3结果显示，无论是大鼠还是小鼠，2种方法所得大鼠和小鼠EEG的相对功率值在各频段的分布均无显著性差异。

Fig.3 Frequency and relative power of EEG in conscious and anesthetized mice(A,B)and rats(C,D)with uncovered and sub-scalp EEG electrode installation method.Relative power（%）=（power at different frequencies/total power）×100%.A and C：the relative power values of EEG obtained by mice and rats in conscious state；B and D：the relative power values of EEG obtained by mice and rats under anesthesia（0.3% pentobarbital，30 mg·kg-1，ip）.±s，n=5-7.

2.3 “头皮包埋式”埋置法分析清醒和麻醉大鼠和小鼠脑电信号

用“头皮包埋式”埋置法分析和比较了戊巴比妥钠麻醉作用对小鼠脑电信号的影响。图4A为麻醉和清醒状态下小鼠EEG实测图。结果显示，麻醉状态下EEG振幅较大，波形高且宽。图4B为2种状态下相对功率曲线图，可见低频段（0～5 Hz）处存在一峰值，高频段处EEG相对功率值曲线较为平缓，整体表现为麻醉状态高于清醒状态。将不同频段相对功率进行进一步比较和分析，结果显示（图4C），在δ波（0.5～3 Hz）中，麻醉状态相对功率较清醒状态低15.6%，θ，α和β波则呈现麻醉状态相对功率高于清醒状态的趋势，分别高出30.5%，416.6%和499.3%，但均无统计学差异。总体而言，在各个频段范围内，小鼠麻醉和清醒状态EEG相对功率无显著性差异。

Fig.4 Frequency and relative power of EEG in conscious and anesthetized mice with sub-scalp EEG electrode installation method.A：EEG in anesthetized and conscious mice；B：frequency distribution curves of the EEG relative power；C：comparison of relative power between consciousness and anesthesia（pentobarbital，0.3%，30 mg·kg-1，ip）groups.±s，n=4.

用“头皮包埋式”埋置法分析和比较了戊巴比妥钠麻醉作用对大鼠脑电信号的影响。图5A为麻醉和清醒状态下大鼠EEG的实测图。结果显示，麻醉状态振幅较高，波型较宽。图5B为2种状态下相对功率曲线图，可见低频段（0～5 Hz）处存在一峰值，高频段处EEG相对功率值曲线较为平缓，整体表现为麻醉状态相对功率曲线位于清醒状态上方。进一步作不同频段相对功率的比较和分析，结果显示（图5C），在各个频段范围内，大鼠清醒和麻醉状态相对功率无显著性差别，但在频率较高范围（3～30 Hz）内，麻醉状态则表现出高于清醒状态的趋势，大鼠θ，α和β波麻醉状态相对功率比清醒状态分别高出10.4%，114.9%和351.9%。

Fig.5 Frequency and relative power of EEG in conscious and anesthetized rats with sub-scalp EEG electrode installation method.A：EEG in anesthetized and conscious rats；B：frequency distribution curves of the EEG relative power；C：comparison of relative power between consciousness and anesthesia（0.3% pentobarbital，30 mg·kg-1，ip）groups.±s，n=3.

2.4 “头皮包埋式”埋置法分析不同周龄大鼠脑电信号

选用7周龄大鼠用“头皮包埋式”埋置法安装电极，分别在第8，10和12周龄时采集大鼠脑电信号，观察大鼠不同周龄脑电信号的变化。结果显示（图6），各周龄段δ波的相对功率不存在统计学差异；θ，α和β波段处，第12周的大鼠EEG相对功率较第8周显著增加（P＜0.05）。

Fig.6 Relative EEG power of different weeks of age in rats with sub-scalp EEG electrode installation method.The method of embedding EEG electrodes under the scalp was adopted to install EEG signal acquisition devices，and EEG signals were collected at 8，10，and 12 weeks of age.±s，n=4-6.＊P＜0.05，compared with corresponding 8-week group.

针对大鼠的周龄和各频段相对功率进行Pearson相关性分析。统计结果（图7）显示，δ，θ，α和β波相对功率与大鼠周龄相关系数（r）分别为-0.874（P=0.161），0.992（P=0.041），0.985（P=0.055）和0.998（P=0.018），表明θ和β波相对功率与大鼠周龄呈显著正相关，随大鼠周龄的增加，θ和β波的相对功率随之增加。

Fig.7 Correlation between relative EEG power and weeks of age in rats with sub-scalp EEG electrode installation method.See Fig.6 for the rat treatment.±s，n=4-6.

3 讨论

传统裸露式颅内电极安装完成后，手术切口裸露的面积大，愈合时间长，损伤的肌肉、骨膜、皮肤等组织让动物产生明显的不适感，尤其是头部大块牙科水泥和颅内电极连接装置妨碍动物的自由活动以及进食进水行为，可增加和促使动物抓挠和剐蹭头部装置，导致颅内电极及连接装置脱落，无法修复，造成人力、时间、科研经费的浪费和损失。有鉴于此，本课题组对传统裸露式颅内电极安装方法改进为“头皮包埋式”埋置法。该法改进如下：①将颅内电极包埋于大鼠或小鼠头皮下，使之能够得到头皮的保护。此方法中分离和缝合头皮组织是否坏死最为关键。本实验结果表明，该法术后头皮组织和新生毛发生长良好，切口完全修复，未观察到头皮组织炎症和溃烂，症状明显轻于传统裸露式安装法。②采用组织胶水黏合头皮切口，术后不存在裸露的手术创面，可明显减轻动物的不适感，减轻抓挠和剐蹭行为，有利于保护颅内电极及其连接装置，防止脱落。由于组织胶水费用较高，在部分预实验中选用了价格低廉的502胶水黏合皮肤切口，收到了同样的效果，即切口愈合良好，可完全修复，但具有一定刺激作用。③尽可能减少牙托水泥的用量，以恰好密封颅钉和裸露导线接头为宜，可避免头部大块牙科水泥对动物自由活动和进食进水行为的妨碍。预实验时，曾经尝试使用热熔胶替代牙托水泥，虽然在包埋颅内电极和绝缘方面可取得相同的效果，但热熔胶的稳定性不如牙托水泥。此外，术中可见热刺激作用。④传统裸露式安装法是颅内电极直接与连接插座硬性连接，动物头顶部包块大，易剐蹭，致使连接装置和颅内电极易脱落，且无法修复。“头皮包埋式”埋置法通过连接导线，实现颅内电极与连接插座间的间接柔性连接，并将连接装置置于动物颈背部，避免其与饲养环境直接碰擦，有利于长久保持。此外，“头皮包埋式”埋置法在插座脱落后，颅内电极和连接导线仍然存在，提供了重新焊接插座、修复连接装置的可能性。本实验结果显示，采用“头皮包埋式”埋置法埋置颅内电极，安装连接装置，大鼠和小鼠头部和颈背部切口可自行愈合，机体功能表现正常，体重增长处于合理范围，进食进水未受明显影响。由此表明，“头皮包埋式”埋置法具有明显的优势和很好的实用性。

鼠笼笼盖的改造可以有效地避免剐蹭行为所造成的颅内电极和连接装置的脱落。“头皮包埋式”埋置法选用厚度为0.1 mm延展性较好的铜片包裹笼盖底部凸起处，并将食物直接放入笼内。此外，单笼饲养可以防止打斗造成的连接装置脱落。安装颅钉时，应注意把握深度，位置过深易损伤脑组织，过浅则影响脑电信号的传导。

除改进手术方法外，完善信号采集环境亦十分重要。在EEG信号的采集过程中，出现信号不稳定、信噪比差等情况，主要是由于信号采集过程中动物活动造成了脑电采集电缆移动、导线张力增加或头部电极装置松动，致使信号接收断开所致。头部电极和测量笼的转轮是脑电记录系统中最关键的部分。安装可靠而稳固的头部电极可极大地避免装置松动，合理的平衡与导线旋转系统可防止其身体扭转或起伏对测量的干扰，并减少电缆在箱内下坠对动物头部造成的拖拽感，还可预防动物啃咬导线［7］。此外，牢固的导线接口、绝缘的测量箱和完全的电磁屏蔽环境也是获得长期稳定的脑电信号的重要条件。

分别采用传统裸露式颅内电极安装法和“头皮包埋式”埋置法对大鼠和小鼠进行了信号采集。实验结果显示，不论是在清醒还是麻醉状态下，这2种方法得到的EEG相对功率均呈现随频率增加而下降的状态，且在同一测定条件下，两者EEG相对功率在各频段的分布状态一致，无显著性差异。以上结果表明，本研究所建立的“头皮包埋式”埋置法与传统裸露式安装法的检测结果具有良好的一致性。

采用“头皮包埋式”埋置法检测得到的大鼠和小鼠麻醉和清醒状态EEG，波形稳定，背景干扰小。信号采集脑区为左右枕叶部位，δ波有较高响应。麻醉状态下，EEG波型变宽，振幅升高，表明麻醉作用使大鼠脑电信号向低频位置转移，相对功率增高。据报道，异氟烷、安氟醚、氟烷和巴比妥酸盐等多种麻醉药品对脑电信号有影响，在深度麻醉状态下均会导致EEG振幅增加［8-9］。本检测结果与上述报道相符。

麻醉无意识状态下脑电活动与睡眠状态相近［10］，大脑EEG会向较慢频率转变，α波逐渐消失，θ和δ波大范围出现［11-12］。本法选用戊巴比妥麻醉，实验结果显示，麻醉状态下大鼠和小鼠θ波相对功率均呈现大于其清醒状态的趋势，增加幅度分别为10.4%和30.5%；α和β波相对功率也出现不同程度的增加，与报道相符［13］。此改变可能是由于进入麻醉状态时，外周神经冲动被阻断，丘脑-皮质神经元环路自发振荡增强，造成大脑皮质高幅慢波比重增加［14］，脑电信号趋于同步化。

大鼠在第8，10和12周时的脑电信号显示，周龄越大，EEG中高频段占比越高，且呈随周龄增加而增加的趋势。与第8周相比较，第12周θ，α和β波相对功率明显增加，第10周也分别增长137.6%，323.6%和493.0%。θ和β频段的相对功率与周龄增长成显著正相关。上述结果表明，大鼠随周龄增长其枕叶部神经元放电趋于去同步化，低幅快波的比重逐渐增大，δ波相对功率随大鼠周龄增加而降低，θ，α和β波相对功率随周龄增加而增大，与文献［15］报道一致。对人脑电研究发现，随年龄增长，β波的相对功率同样会出现显著增加［16］，δ波相对功率表现为下降趋势［17］。据报道，老年大鼠（15～17月龄）α和β波相对功率较年轻大鼠（2～3月龄）更高，而δ和θ波相对功率则分别呈增加和降低的趋势［13］，本实验结果与此不完全一致，可能与实验动物的年龄差异、脑电采集脑区不同等实验条件有关。

综上所述，电极“头皮包埋式”埋置法不仅可实现大鼠和小鼠脑电信号的采集分析，还具有更加稳固、创伤小、感染率低、成本低廉和检测线拆卸灵活等特点，且具有更加可靠、稳定和持久的优点，可用于测定大鼠和小鼠EEG信号。