武瑞君，桑晓冬，李治非，敖 翼，范 玲

（中国生物技术发展中心，北京 100039）

抗体类生物治疗药物因其具有靶向性强、特异性好、治疗效果显著等优点，在生物药中占据着举足轻重的地位［1］。近年来，抗体药物获批数量显著增加，市场占有率节节攀升，成为生物药中增长最快的领域。随着抗体药物的需求不断加大，抗体技术的发展也日新月异，从多克隆抗体制备到单克隆抗体筛选，取得了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体到全人源抗体等一系列突破性的成果，抗体技术成为生物技术领域特别是生物医药领域研究的热点。抗体药物随着抗体技术的不断创新而发现，同时技术创新又加速了新的抗体药物的研发速度和生产水平的提升［2-4］。不断创新抗体技术等关键核心技术，将变革性新技术应用于抗体等药物的研发，对推动我国抗体药物自主研发乃至新药创制具有重要意义。本文介绍抗体技术发展历程，系统综述杂交瘤单克隆技术、抗体文库展示技术、转基因动物技术和单细胞测序技术等最新技术，对抗体新技术研发的重要性进行分析，并对未来发展予以展望。

1 发展历程

伴随着抗体的发现和对抗体认识的不断加深，抗体技术的研究正在不断拓展。广义的抗体技术包括抗体的生产及与应用相关的所有技术，狭义的抗体技术则是指与抗体生产相关的技术。根据发展历程，抗体技术可分为多克隆抗体技术、杂交瘤单克隆抗体技术和基因工程抗体技术3个阶段。

1.1 多克隆抗体技术

多克隆抗体发现于19世纪末。1890年，德国科学家Behring和日本科学家Shibasaburo发现，用白喉毒素免疫动物获得的免疫血清中有一种能够中和白喉毒素的物质存在，这种白喉毒素的抗血清即为一种多克隆抗体［5］。多克隆抗体的制备多通过免疫动物获得，当抗原注射到动物体内后就会产生针对该抗原的抗体。大多数抗原表面成分复杂，具有多种不同的抗原表位，因而免疫血清中产生的抗体为针对多种抗原成分或抗原表位的、综合的、不均一的多克隆抗体［2］。目前，恢复期患者血浆疗法用于急性病毒性传染病的应急治疗仍受到广泛关注，如在流感、埃博拉、严重急性呼吸综合征（SARS）及新型冠状病毒肺炎（COVID-19）流行期间均使用患者恢复期血浆疗法进行治疗或临床研究［6］。

1.2 杂交瘤单克隆抗体技术

单克隆抗体出现于20世纪70年代。1975年，英国科学家Kohler和Milstein将能够产生抗体的B淋巴细胞和肿瘤细胞融合［7］，成功建立了杂交瘤单克隆抗体技术，成为第二代抗体生产技术。体外培养的B淋巴细胞能够产生抗体但不能长期存活，而肿瘤细胞可以无限繁殖，将二者融合，融合后的子代细胞既可产生抗体，又能够无限传代，从而获得抗体纯度高、理化性质均一、特异性强的单克隆抗体［3］。

1.3 基因工程抗体技术

基因工程抗体出现于20世纪80年代早期。1984年，Morrison等［8］首次报道了人鼠嵌合抗体。基因工程抗体亦称为重组抗体，是指利用重组DNA和蛋白质工程技术等对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。利用基因工程抗体技术减少抗体鼠源成分，增加人源化程度，降低免疫原性，成为第三代抗体技术［4］。目前常见的技术包括鼠源抗体人源化技术，以及抗体文库展示技术、转基因小鼠技术和单细胞测序技术等人源抗体筛选技术。

2 最新研究进展和应用

随着现代生物技术的不断发展，结合抗体药物的生物学特性，研发人员在传统抗体技术的基础上不断优化创新，力求通过更简便快速的方法，获得免疫原性更低、人体相容性更好及成本更低的治疗性抗体。

2.1 杂交瘤单克隆抗体技术

杂交瘤单克隆抗体技术是在体细胞融合技术基础上发展而来，将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成在体外长期存活并分泌免疫球蛋白的杂交瘤细胞，通过克隆化得到来自单个杂交瘤细胞的杂交瘤单克隆细胞系，生产大量单克隆抗体（图1）。此过程中，杂交瘤细胞2次筛选至关重要［9］。最传统的二次杂交瘤筛选方法为有限稀释法［9］。该方法操作简单，不需要特殊设备，但人工操作速度慢、效率低、耗时长、易出错，不能满足高通量筛选的要求。流式分选技术也较多用于杂交瘤细胞的筛选，在细胞表面或细胞内标记荧光信号，通过荧光信号强度反映细胞的抗体表达水平，并将收集高荧光信号强度的细胞，再通过有限稀释或单细胞收集器得到高水平表达的单克隆［10］。该方法具有自动化速度快和精确度较高等优点，但需要对细胞进行荧光标记，且检测结果易受细胞周期影响。

图1 杂交瘤技术联合鼠源抗体人源化技术路线示意图.PEG HAT：聚乙二醇次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷培养液.

随着技术进步，目前一种新的杂交瘤筛选技术——全自动细胞筛选系统（Cellcelector）得到广泛使用。该方法使用半固体培养，使细胞生长成单个独立、分散、无法移动的单克隆，加入荧光标记克隆检测试剂并捕获目标抗体后，在细胞克隆中形成荧光晕状物质。通过比较克隆细胞与克隆细胞周围晕直径的大小，计算出产生抗体的比例，即质量系数。用机械臂及挑头自动化挑取质量系数最高的细胞克隆获得最高的抗体生产克隆［11-12］。作为最新一代技术，该全自动细胞筛选系统具有高通量，自动化，高效率，可编程、量化和存档及追溯等优点，可缩短研发周期，降低成本。

杂交瘤单克隆抗体技术方便、简单、成本低，但仅能用于鼠源抗体筛选。1986年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市的第一个抗体药物莫罗单抗（muromomab-CD3）即为用杂交瘤技术筛选的鼠源抗体，但鼠源抗体能够被人体免疫系统识别，引起强烈的人抗鼠抗体反应，使得药物疗效减弱，并引起严重的不良反应。因此，利用杂交瘤技术直接获得的鼠源抗体药物在临床应用上受到极大限制，除少数化疗用鼠源抗体仍在临床使用外，鼠源抗体基本已被淘汰。为解决这一问题，科学家利用基因工程方法对鼠源抗体进行人源化，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应。直至1994年，美国FDA才批准了第二个抗体药物即人鼠嵌合抗体药物阿昔单抗（abciximab）上市。此后，通过杂交瘤技术筛选得到抗体通常需要进一步进行人源化改造，才能作为抗体药物进入临床应用。

2.2 抗体文库展示技术

抗体文库展示技术是近30多年快速发展起来的一项技术，已成为抗体工程的前导工具。由于不能直接用杂交瘤技术获得人源抗体，所以抗体文库展示技术主要用来筛选人源抗体。利用聚合酶链反应（PCR）从B细胞中扩增出抗体的重链和轻链群，将它们连入合适的载体表达随机的联合抗体文库（图2）。按抗体基因来源，目前抗体库主要有天然抗体库、半合成抗体库、全合成抗体库和混合抗体库等类型。同时，随着计算机辅助分析和虚拟设计的发展，还发展出表位特异性的靶向抗体库技术平台。根据抗体文库所用载体的不同，目前主要的技术有噬菌体展示技术、酵母表面展示技术、核糖体展示技术和mRNA展示技术等［13］。

图2 抗体文库展示技术路线示意图（噬菌体展示文库为例）.

噬菌体展示技术的基础为噬菌体侵蚀细菌并利用细菌表达自身外壳蛋白等过程。1985年，Smith等［14］第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，创建了噬菌体展示技术。该方法纯化步骤简单，不要求昂贵的试剂和设备，但是存在肽库容量只能达到1×109、系统依赖于细胞内基因表达等缺点，且噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，一定程度上限制了文库中分子遗传多样性［15］。2002年，美国FDA批准上市的首个全人源抗体药物阿达木单抗（adalimumab）就是利用噬菌体展示文库筛选得到的。同时，具有结构简单、相对分子质量小、稳定性强、易于重组改造、组织穿透力强等优点的纳米抗体，也通常是利用免疫羊驼联合噬菌体展示文库技术筛选而来，如2018年9月美国FDA批准上市的目前唯一一个纳米抗体药物卡普赛珠单抗（caplacizumab），即是利用该技术研发得到。

酵母细胞表面展示技术是一项真核蛋白展示技术。1997年，Boder和Wittrup等［16］将抗荧光素蛋白的单链可变区与α凝集素结合亚基的N端融合，首次建立了酵母展示系统。作为真核表达系统，酵母细胞表面展示技术可以对蛋白进行翻译后修饰，且真核分泌系统有“质量”控制机制，能阻止错误折叠的蛋白被输运出内质网。此外，可使用流式细胞术对已构建的酵母细胞库进行定量和实时筛选，高效便捷［13］。2020年，美国FDA批准在巴斯德毕赤酵母细胞表达得到的抗体药物依普奈珠单抗（eptinezumab）上市，使其成为首个酵母表达的抗体药物。目前该技术也被用于纳米抗体的开发。

此外，核糖体展示技术［17］和mRNA展示技术［18］作为新兴的克隆展示技术，完全在体外进行。通过构建DNA文库，在体外进行转录与翻译，最终形成“mRNA-核糖体-蛋白质”（核糖体展示技术）或“cDNA-mRNA-蛋白质”（mRNA展示技术）三聚体，使目的蛋白的基因型（mRNA）和表型（蛋白质）联系起来，最后从中分离mRNA或cDNA进行逆转录PCR（RT-PCR）扩增。该类技术与噬菌体或酵母细胞展示技术相比，具有建库简单、库容量大、分子多样性强、筛选方法简便、可通过引入突变和重组技术提高靶标蛋白亲和力等优点。同时，mRNA展示技术经逆转录形成的cDNA/mRNA杂交双链，还避免了RNA二级结构和三级结构对体外筛选的干扰［19］。目前，越来越多的研究人员将该类技术应用于新药开发等领域。如二磷酸腺苷核糖基化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，广泛存在于多种病毒、细菌和真核生命体内，在调节炎症信号通路中发挥重要作用。然而，该种修饰在细胞内丰度相对较低，并处于单体修饰和多聚体修饰2种形式的动态变化中，缺乏商用的特异性抗体，限制了研究人员对其进行大规模研究。苏黎世大学Micheal团队使用核糖体展示技术和定向进化策略，获取了一种突变体eAfr1521，并将其应用于二磷酸腺苷核糖基化修饰的研究，为后续研发提供了新的工具和策略［20］。

2.3 转基因小鼠技术

1985年，科学家首次提出将人源抗体基因导入小鼠生殖细胞，通过建立转基因小鼠来生产人源抗体的建议，该想法的提出开创了人源抗体生产研发的新思路［21］。1989年，Brüggemann等［22］首次构建了人源抗体重链基因载体，将人IgG基因座转入小鼠体内，引起基因重排并表达IgM。转基因小鼠技术是应用基因工程技术破坏小鼠内源抗体基因，然后将人抗体基因转入小鼠体内，再使用目标抗原免疫转基因小鼠，从而在其体内表达相应抗体的技术（图3）。该技术使抗原抗体免疫反应在小鼠体内进行，保证了抗体类别转换的完整性、抗体克隆选择的多样性及抗体亲和力成熟的自然机制，因此利用该技术得到的抗体具有良好的亲和性、稳定性和可溶性等。由于该技术体系难度较大，具有技术壁垒高的特点，仅有少数公司掌握，主要有XenoMouse，UltiMab，VelociImmune和Kymab等转基因小鼠。

图3 转基因小鼠技术路线示意图.

XenoMouse小鼠、UltiMab小鼠、VelociImmune小鼠和Kymab小鼠分别是美国Cell Genesys公司、Medarex公司和再生元（Regeneron）公司及英国Kymab公司研究人员培育而成。XenoMouse小鼠与UltiMab小鼠作为第一代转基因小鼠，技术类似，均转入了人IgH和Igκ的主要基因，同时小鼠自身的IgH和Igκ失活。VelociImmune小鼠和Kymab小鼠类似，将小鼠的IgH和Igκ的V区精确地替换为对应的人IgH和Igκ的V区，同时保留了小鼠自身所有C区和其他基因表达调控原件。利用上述4种转基因小鼠均有获得美国FDA批准上市的抗体药物，其中美国Medarex公司利用UltiMab小鼠研发的抗体药物获批最多，达10个，如2009年获批的4个抗体药物卡那单抗（canakinumab）、优特克单抗（ustekinumab）、戈利木单抗（golimumab）和奥法木单抗（ofatumumab）及2014年获批程序性死亡受体1抗体纳武单抗（nivolumab）。美国再生元公司利用转基因小鼠开发埃博拉病毒中和抗体。2020年，美国FDA批准的首个埃博拉抗体疗法因马泽布（inmazeb）即利用转基因小鼠技术研发。COVID-19疫情期间，美国再生元公司也利用该转基因小鼠技术开展了新型冠状病毒中和抗体的研发工作。

目前，我国研究团队也在积极建立转基因小鼠相关研发体系。和铂医药公司培育了Harbour小鼠，拥有H2L2和HCAb 2个品系。H2L2小鼠能产生具有2条全人源重链和轻链的单克隆抗体，HCAb小鼠能产生独特的具有全人源可变区片段的重链抗体。重庆市畜牧科学院培育了CAMouse小鼠，拥有全人抗体转基因小鼠CAMouseHG和全人单域抗体转基因小鼠CAMouseH2个品系。

2.4 单细胞测序技术

单细胞测序技术即单个B淋巴细胞抗体制备技术，是近年来新发展的一类快速制备单克隆抗体的技术，是根据每个B细胞只含有1个功能性重链可变区DNA序列和1个轻链可变区DNA序列，以及每个B细胞只产生1种特异性抗体的特性，将单细胞分离鉴定技术结合PCR技术形成的一种全人源单克隆抗体的体外表达系统（图4）。利用该技术产生的抗体具有全人源性、高度抗原特异性、亲和性高和基因多样性丰富等优势，被广泛应用于肿瘤治疗、病原微生物感染治疗、自身免疫疾病检测和治疗及人类免疫系统研究等各个领域［23］。单细胞测序技术主要包括单个B细胞分选，抗体基因扩增和克隆及抗原特异性抗体表达、筛选和鉴定等过程。如何分选得到单个B细胞是单细胞测序技术最重要的挑战之一。相对传统的B细胞分选策略是通过溶血空斑技术［24］、显微操作法、磁珠分选法［25］、流式分选法［26］和激光切割法等技术，将单个细胞分离捕获至容器，具有精确和节省细胞等优点，但单个细胞操作成本较高。随着单细胞测序技术飞速发展和细胞分选技术的不断优化和改进，目前有以下几种较成熟的技术或平台。

图4 单细胞测序技术路线示意图.

单液滴微流控技术（Drop-seq）是一种通过微流控装置，将细胞和带有条码、分子标签的引物微珠一起装入微小的液滴中，其中条码用于标记细胞，分子标签用于标记转录本，每个液滴作为逆转录和PCR的微小反应室，含有1个细胞和1个微珠。同1个细胞的mRNA被标记上相同的条码，因此可以通过条码区分不同细胞的转录本。目前常用的商业化单细胞测序平台10×Genomics就是基于该技术衍生而来，利用“双十字”微流体交叉系统，横向孔道逐个导入凝胶微珠，第一个纵向道输入细胞，凝胶微珠和细胞碰撞被吸附在微珠上，然后通过微流控技术运送到第二个纵向的“油管”通道，形成一个个油滴凝胶微珠。每一个凝胶微珠都布满了不同的条码和分子标签连接的序列，细胞裂解后进行转录、测序。该方法具有操作简便、耗时短、成本低、通量高等优点，建库仅需约12 h，7 min内可完成100～80 000个细胞的捕获［26］。

单孔板测序技术（Microwell-seq）是基于微孔板和带有条码的引物，对大量的细胞进行转录组分析的方法。该技术与Drop-seq不同之处在于把微液滴换成了微孔，将细胞悬液和带有条码的引物微珠铺在微孔板的微孔中，使每个微孔含有1个细胞和1个微珠，细胞裂解后，细胞中的mRNA被微珠捕获，这样同1个细胞中的mRNA都带有相同的条码标记，然后混在一起进行转录和测序［27］。

Beacon单细胞光导系统是美国Berkeley Lights公司开发的一款能够快速进行单细胞分析的细胞分选和成像系统，通过整合微流控的纳升级微反应器技术、光电定位技术以及计算机系统等，实现单细胞分选、培养、检测和收集的自动化和一体化。其中基于Beacon系统的抗体早期发现流程可以概括为免疫和抗体分泌细胞富集、抗体分泌细胞铺板、抗性克隆鉴定、阳性克隆挑选及抗体序列获取、克隆和表达等5个环节。该技术对常规方法进行了系统革新，大大缩短了研发周期，提高了研发效率［28］。

单细胞测序技术可以实现高通量筛选和测序，目前在抗体药物筛选领域应用日趋广泛，由于该技术近10年才高速发展，暂无获批上市的药物，但有多个利用该技术研发的药物正处于临床试验阶段，如拟用于治疗巨细胞感染的司韦单抗（sevirumab）和治疗癌症的普林木单抗（pritumumab）等。其中，由美国渤健（Biogen）生物技术公司研发的阿杜卡尼单抗（aducanumab）备受关注，该单抗是一种靶向寡聚β淀粉样蛋白、用于治疗阿尔茨海默病的研究性药物。研究人员对比了来自无认知障碍健康老年受试者和具有缓慢认知衰退的老年受试者的B细胞文库，利用单细胞测序技术开发了人源重组单克隆抗体阿杜卡尼单抗。研究结果显示，接受阿杜卡尼单抗治疗的患者在认知和功能指标如记忆、定向和语言方面获益显著，个人理财、做家务（如清洁、购物和洗衣）以及独立外出旅行等日常生活活动也有获益［29］。该公司于2020年7月向FDA提交了阿杜卡尼单抗生物制品许可申请，美国FDA于2020年8月受理，并授予了优先审查，目前正在同时接受欧盟和日本监管机构的审查。COVID-19疫情期间，单细胞测序技术成为研发新冠病毒中和抗体的主流技术，美国礼来（Eli Lilly）公司联合加拿大AbCellera Biologics公司、韩国国立保健研究院等团队，以及中国科学院微生物研究所、清华大学和北京大学等多个中国团队开展相关研究，其中LY-CoV555（美国礼来公司团队研发）和JS016（中国科学院微生物研究所团队研发）组成的中和抗体联合疗法于2021年2月9日获批美国FDA紧急使用授权［30-33］。

3 不同抗体技术优势和劣势对比

杂交瘤单克隆抗体技术、抗体文库展示技术、转基因小鼠技术和单细胞测序技术作为4种常用的抗体技术，各自具有不同的优势和劣势（表1）。

表1 4种主要抗体技术优势和劣势对比

杂交瘤单克隆抗体技术成熟、方便、成本低，但是仅能用于鼠源抗体筛选，且鼠源抗体能够被人体免疫系统识别，引起严重的不良反应，因此利用杂交瘤技术筛选得到抗体通常需要进一步进行人源化改造。

与杂交瘤单克隆抗体技术相比，抗体文库展示技术省去了细胞融合的步骤，扩大了筛选容量，可以直接得到人源化抗体基因，且抗体文库展示技术正在快速发展，不断衍生出体内、体外、真核等不同的表达系统，为筛选鉴定特异性抗体提供了更多方便的平台。但目前抗体文库展示技术仍不能广泛用于完整IgG抗体的展示，需要首先片断化展示后重建完整抗体分子，易筛选到非特异性的结合或亲和力低下的抗体，且抗体库难以储存和运输，是相关科研材料共享的一大阻碍。在美国FDA已批准上市的抗体药物中，利用该技术筛选的仅占约10%。如何克服以上问题将是未来该技术发展的重要方向。

尽管首个全人源抗体来自噬菌体展示技术，但转基因小鼠技术仍是目前全人源抗体药物领域应用最广泛的主流技术，具有高效、快速和对人体蛋白具有较好的免疫原性等优点。利用该技术产生的抗体整体上成功率更高，已研发出治疗银屑病、黑色素瘤和高胆固醇血症等多种疾病的全人源单克隆抗体。截至2019年11月，美国FDA批准的30个全人源抗体药物中，有21个来自转基因小鼠技术，占比70%。但由于人和小鼠之间免疫系统组成存在差异，如何通过转基因小鼠获得更接近人体天然产生的抗体结构，仍然是未来研究的主攻方向。

单细胞测序技术具有快速、高通量、不受转化效率的限制等优点，可直接从B细胞筛选全人源性、高特异性、高亲和性的抗体，且随着一些先进仪器用于单细胞测序平台，该技术已成为筛选病毒类抗原抗体的主流技术。目前该技术还未完全发展成熟，且抗体来源受限于B细胞，较难获取靶向自身抗原的抗体，但未来仍有很大的开发空间和应用前景。

4 分析和展望

抗体药物以其独特的优势，在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染类疾病的诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用，具有广阔的应用前景。2021年2月11日，美国FDA批准再生元公司研发的血管生成素样蛋白3抗体依维苏单抗（evinacumab）上市，作为全新作用机制的降脂药，用于患有纯合子家族性高胆固醇血症的≥12岁儿童和成人患者，商品名为Evkeeza。依维苏单抗的获批标志着美国FDA批准的抗体药物达到100个。伴随着不同学科的汇聚和深度融合、分子生物学技术和重组抗体技术的不断完善和高通量测序技术的飞速发展，抗体技术在不断进步和革新，抗体药物也不断朝着免疫原性更低、人体相容性更好、成本更低等方向发展。因此，加强可转化底层技术的基础研究，不断创新抗体技术等关键核心技术，提升创新药物研发技术平台能力建设，不断将变革性新技术应用于抗体等药物的研发，对推动我国抗体药物自主研发乃至新药创制具有重要意义。

4.1 加强基础研究，提高源头创新能力

目前我国进入临床研究的创新药物多为国外已知靶点和先导化合物的跟踪性创新药物，基础研究薄弱是我国医药产业发展长期受制于人的根本原因之一。因此，包括抗体药物研发在内的新药研发要主动对接科技前沿新突破，持续加强新靶点的发现与验证、药物作用的新机制等基础研究，提高我国新药创制的基础研究水平，逐步掌握创新引领的主动权，从模仿创新转变为在某些方向上实现原始创新，全面提高源头创新能力。

4.2 加强制约发展的关键核心技术突破，全面提升核心竞争力

关键核心技术对优化新药创制体系、促进制药产业转型升级以及实现自主可控具有至关重要的战略意义。抗体药物研发经历了多克隆抗体技术、杂交瘤单克隆抗体技术到现在的单细胞测序技术等一系列技术迭代，显著提高了药物研发效率。因此，要围绕制约抗体药物研发技术、抗体衍生物研发技术（如双功能抗体、纳米抗体和抗体支架展示技术等）以及抗体进一步应用技术（如嵌合抗原受体T细胞技术、嵌合抗原受体NK细胞技术和抗体药物偶联物等）等新药创制不同阶段的关键核心技术，结合我国新药创制现状，突破共性关键技术，开展高通量药物筛选新技术、高通量测序技术、人源化动物模型构建技术、人工智能药物设计技术、智能药物制备技术、质控技术和佐剂研发技术等关键技术研发，全面提升我国新药创制的核心竞争力。

4.3 避免同质化竞争，形成产品专利保护树

目前我国药物研发同质化竞争严重，聚焦单一靶点往往有几十种以上的在研药物，导致“多、小、散”现象凸显。因此，在立足自主创新、寻找差异化的同时，要高度重视知识产权工作，加大对原始创新的激励保护，用知识产权铸造发展利器。在抗体等药物整个研究与开发的全过程，重视对研发技术、产品组方、活性成分、质控方法、制剂及新的医药用途等方面实施全方位的专利保护和布局，形成产品专利保护树，稳固主要核心产品的市场地位。