何唯唯，徐 华，瞿敏敏，张雅姣，徐 斌，谢剑炜

（军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

核酸的表观遗传修饰可在不改变遗传密码或DNA序列的情况下，改变DNA或RNA的结构和生物化学性质，并通过发育、增殖过程将这种改变进行稳定遗传，从而实现细胞与个体的多样性。因此，核酸修饰与多种复杂生物过程有关，如细胞分化、基因组印迹和X染色体失活等。迄今已发现并鉴定了17种DNA修饰和至少160种RNA修饰［1-2］，其生物学功能的研究促进了表观基因组学及表观转录组学的发展［3］。“修饰组学”概念的提出，进一步阐明了DNA和RNA修饰与蛋白质修饰之间的紧密联系，即核酸和组蛋白的表观遗传修饰对基因时空表达的DNA复制、转录、翻译及翻译后修饰4个阶段进行调控，从而控制生成不同类型的细胞，最终体现为生物体的性状和病理生理等差异［4］。因此，核酸修饰的鉴定越来越受到关注，已成为生命科学领域的研究热点。

DNA甲基化作为最常见的核酸修饰类型，普遍存在于生物界各类物种，参与动态调控生理功能［5］，与人体正常生长发育密切相关的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）和N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，6-mA）2种类型受到广泛关注。5-mC主要以CpG二核苷酸的形式聚集在CpG岛内，其功能性结果通常是造成长期、稳定的基因沉默，最终对基因表达、基因组印迹和X染色体失活等产生影响［6-8］。5-mC 可在 TET（ten-eleven translocation）双加氧酶作用下逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）、5-醛基胞嘧啶（5-formylcytosine，5-foC）及5-羧基胞嘧啶（5-carbox-ylcytosine，5-caC）［9］，随后通过碱基切除替换成正常的胞嘧啶，实现主动去甲基化。此过程广泛发生，可对细胞生长、干细胞维持和胚胎发育产生影响［7］。6-mA最初发现于细菌基因组，与修复和基因表达调控等防御和生存过程密切相关。近年发现，6-mA也同样存在于植物、脊椎动物和哺乳动物等真核基因组中，参与发育过程的基因表达调控，且差异分布于早期胚胎形成过程中，在AlkB家族的脂肪质量与肥胖相关蛋白（fat mass and obesity associated protein，FTO）、NMAD-1、DNA中6-mA 去甲基酶及烷基化修复同系物1（alkylation repair homolog 1，ALKBH1）等蛋白质的介导下，可发生与TET双加氧酶的氧化去甲基化作用相似的过程，产生N6-羟甲基腺嘌呤（N6-hydroxymethyladenine，6-hmA）［10-14］。

然而，核酸修饰在体内的丰度通常非常低。例如，DNA中5-hmC和RNA中hm5C的比例可低至百万分之一［11-12］。因此，特异性强、灵敏度高且具有良好选择性的检测方法是破译这些修饰功能的关键。质谱具有良好的灵敏度和选择性，已发展为最具潜力的核酸修饰分析技术，其中液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术可对目标物进行鉴定和定量分析，已被广泛应用于核酸修饰研究中［15-22］。

目前已成功发展了多种基于LC-MS/MS的核酸修饰分析方法，主要基于电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI）的负离子分析模式，结合多反应监测模式，以降低背景噪声干扰，从而提高灵敏度和选择性［13］。其基本策略通常为：将大分子核酸降解为核苷酸或碱基，经LC-MS/MS技术进行核酸修饰的鉴定和（或）定量。此外，还可通过汇总多种不同酶切方式的寡核苷酸结果获得序列覆盖率，实现序列中修饰的间接LC-MS/MS定位［16］。本文总结基于LC-MS/MS技术的核酸修饰分析的研究进展，并对其在生命科学和毒理学等领域的应用前景予以展望。

1 基于LC-MS/MS的核酸修饰分析方法

1.1 样品预处理

在LC-MS/MS分析前，需首先进行一系列的样品前处理，以减小生物样品中大量存在的基质效应干扰。基于LC-MS/MS的核酸修饰检测主要有2种分析策略：一种为以核苷作为目标物的准确定量分析；另一种则基于某段寡核苷酸序列，对其中的修饰位点进行识别和鉴定［18］。首先需明确所需的细胞或组织类型，对复杂组织进行物理分离及细胞分选，以获得目标组织或细胞；然后从中提取并纯化DNA或RNA，进而利用酸解或酶解法将核酸裂解，使其以碱基或核苷形式存在；最后再进入LC-MS/MS系统进行分离分析。

1.1.1 核酸水解产物的直接分析

LC-MS/MS常采用酸解或酶解法。酸解法主要获得的分析单元为碱基，是将核酸分子直接在较高温度、剧烈条件下与甲酸反应，使碱基直接解离下来，再用质谱检测其中5-mC和5-hmC等类型的响应强度，并计算全基因组、单细胞等范围内甲基化程度［19-21］。若在酸解前结合亚硫酸氢钠还原法及聚合酶链式反应扩增过程，则可通过LC-MS/MS对扩增产物实现特定区域DNA甲基化程度的定量分析［22］。

相较于酸解法，酶解法的反应条件相对温和，属于“逐级”降解。对于双链DNA，首先进行解旋，再将解旋后的单链DNA酶解成单核苷酸，此后再对单核苷酸的磷酸基团进一步酶解，最终以核苷形式进行色谱分离和质谱检测，进而计算核苷酸修饰程度及比例。核酸酶解中常用的酶主要有脱氧核糖核酸酶Ⅰ［23-24］、核酸酶P1［25-26］、磷酸二酯酶［27-28］、碱性磷酸酶［29］以及适用于多种结构核酸的全能核酸酶［30-31］等（表1）。

表1 核酸酶解中常用的酶

近年来发展了多种基于酶解法的核酸修饰分析新方法。2020年，针对DNA酶解缓冲液、共洗脱残留以及未修饰核苷酸抑制待测修饰核苷酸的质子化问题，汪海林课题组建立超高效LC-MS/MS（ultra performance LC-MS/MS，UPLC-MS/MS）方法，利用碳酸氢铵作为流动相添加剂，提高气相中的质子化能力，促进质子转移到目标核苷酸上，以同时消除这些干扰，实现了DNA中胞嘧啶修饰（5-mC，5-hmC，5-foC和5-caC）的无质子化抑制和灵敏定量检测［32］。

袁必锋课题组基于限制性酶切-体积排阻超滤体系，去除了真核生物细胞组织中来自细菌等原核生物核酸修饰的干扰［10，33］；继而建立了基于荧光素标记及生物素-亲和素反应的磁珠捕获方法，对外周血循环肿瘤细胞进行富集、裂解和酶解，发现其中同时存在DNA低甲基化及RNA高甲基化现象［34］。该课题组用中性酶、温和条件进行酶解后，对RNA中的多种修饰进行检测，首次在哺乳动物RNA中检测出2-羟甲基鸟嘌呤（2-hydroxymethylguanine，hm2G）修饰类型［35］。此方法体系的建立将甲基化定量扩展到单细胞水平，但目前发现的限制酶主要针对DNA甲基化（5-mC和6-mA）及其氧化衍生物（5-hmC），其他修饰类型较少，主要原因是单一的限制性内切酶只能对特定序列进行识别，故酶切法对序列的特异性要求较高，这使其实际应用受到一定限制。

1.1.2 核酸修饰的化学衍生-质谱分析

尽管LC-MS/MS等对大多数核酸修饰的检测灵敏度较高，但对于微量样品的核酸修饰分析，或一些体内丰度极低的核酸修饰类型的检测，直接分析法的灵敏度仍无法满足其要求。化学衍生及标记法通过在水解获得的核苷酸产物上共价键合衍生化基团，以改变分析物的理化性质，从而提高色谱分离效果和ESI的离子化效率［36］，最终提高LCESI-MS的检测灵敏度［37-40］。以下根据衍生化试剂的特征基团及反应类型进行分类，总结化学衍生-质谱技术的核酸修饰分析方法研究进展（表2）。

存在于DNA和RNA上的胞嘧啶修饰丰度差别较大，不易直接进行同时定量检测。袁必锋课题组利用溴乙酰基与胞嘧啶上N3和N4位形成稳定五元环的反应，实现了对DNA和RNA上甲基化胞嘧啶及其氧化去甲基化产物的同步和高灵敏检测［41］。此后，又根据此类衍生化反应对RNA中的双甲基胞嘧啶修饰及其氧化产物，即2′-O-甲基-5-甲基胞嘧啶（2′-O-methyl-5-methylcytidine，m5Cm）、2′-O-甲基-5-羟甲基胞嘧啶（2′-O-methyl-5-hydroxymethylcytidine，hm5Cm）、2′-O-甲基-5-醛基胞嘧啶（2′-O-methyl 5-formylcytidine，fo5Cm）和2′-O-甲基-5-羧基胞嘧啶（2′-O-methyl-5-carboxylcytidine，ca5Cm）进行了衍生化检测，发现这4种胞嘧啶修饰主要存在于＜200 bp的小RNA中，且m5Cm会在ALKBH1蛋白作用下氧化成hm5Cm和fo5Cm，可能与DNA和RNA发生的TET双加氧酶介导5-mC主动去甲基化机制类似［42］。

基于嘧啶类碱基N3这一活性位点，该课题组最近又开发了新的衍生化方法，利用N-环己基-N′-β-（4-甲基吗啉鎓）乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐〔N-cyclohexyl-N′-β-（4-methylmorpholinium）ethylcarbodiimide p-toluenesulfonate〕中的碳化二亚胺基团与尿嘧啶上N3位亚氨基的反应，提高了反相色谱的分离效率及ESI离子化效率，首次在哺乳动物mRNA中发现了5-甲基尿嘧啶（5-methyluridine，m5U）这一修饰类型，并通过稳定同位素细胞代谢示踪发现其中甲基来源于S-腺苷-L-甲硫氨酸［43］。

对于5-foC和5-caC等核酸修饰，也可采用羰基类衍生化反应提高LC-MS检测灵敏。该课题组利用酰肼和胺等与羰基缩合形成腙的衍生化反应开发了一种氧化衍生化联合质谱方法（oxidationderivatization combined with MS，ODMS），将RNA中hm5C用MnO2氧化成fo5C，然后与丹磺酰肼反应，产生易带电的叔胺腙衍生物，显著提高了LC-MS中fo5C的离子化效率［44］。基于同类成腙反应，该课题组又建立了一种管内固相微萃取与吉拉德P试剂（Girard P，GirP）衍生化相结合的分析策略，利用带负电的羧基填料对带正电荷的衍生化产物进行富集，消除了未修饰核苷的干扰，实现了对来自哺乳动物DNA和RNA中6种醛基化修饰核苷，即DNA中的5-foC及RNA中的fo5C、5-醛基尿嘧啶（5-formyluracil，fo5U）、fo5Cm 和 2′-O-甲基-5-醛基尿嘧啶（2′-O-methyl-5-formyluridine，fo5Um）的同步检测［45］。

张新祥课题组基于5-foC到5-caC的主动氧化反应，用含有疏水性三嗪基和2个易带电的叔胺基肼类试剂i-Pr2N与DNA上5-foC的羰基氧及5-caC羧基氧进行快速、同时衍生化反应，实现了超灵敏LC-ESI-MS/MS检测［46］。此外，Zhou等［47］使用氰基磷叶立德试剂（YC-CN）与DNA中5-foC上醛基的Wittig反应，在5-foC上构建了一个高特异性荧光开关，引入光辅助三重“多米诺”反应，实现了5-foC的高灵敏、快速检测，并从反应机制角度实现了5-foC和5-foU的区分。

近年来，化学衍生LC-MS/MS研究也针对磷酸、戊糖上的修饰位点开发了系列衍生化质谱检测新方法。袁必锋课题组分别以N，N-二甲基对苯二胺和8-（重氮甲基）喹啉为衍生化试剂，利用胺及重氮基与磷酸上羟基发生的缩合反应，实现了5-甲基-2′-脱氧单磷酸胞苷和5-甲基-单磷酸胞苷等10种单磷酸核苷及哺乳动物组织和细胞中12种内源性三磷酸核苷的高灵敏检测。这些对核苷以外形式的修饰研究证明了游离态修饰核苷酸的普遍存在，其可能在DNA复制和转录过程掺入核酸［48-49］。此外，该课题组利用金属氧化物CeO2的高亲和性和特异性，对复杂生物样品中携带顺式二羟基的核糖缀合物进行选择性捕获。在此基础上，用丙酮和丙酮-d6上的醛基与富集核苷上的羟基缩合，然后对丙酮和丙酮-d6衍生化产物在相同条件下电离，进行MS检测，显著提高了检测特异性，鉴定出人尿液中49种RNA上的核糖缀合物，其中7种含量在健康对照组和淋巴癌患者间具有显著差异［50-52］。此外，蔡宗苇课题组使用类似策略，将尿液样本中可鉴定的修饰核苷增加到52种［53］。

总之，化学衍生化法是一种有效的前处理方法，可显著改善低丰度核酸修饰分析的灵敏度和特异性，实现特异且高效的定量及测序应用，且有助于新类型核酸修饰的发现，以及疾病、表观遗传毒理学相关机制研究的探索。但当前的衍生化方法尚未解决过量衍生化试剂及副产物生成的干扰，仍需开发更有效的化学衍生化策略。

1.2 基于质谱的核酸修饰位点鉴定

表观遗传修饰的位点序列信息是了解其生物学功能的基础。修饰核苷的鉴定及准确定量检测可从整体角度获得基因组DNA及多种类型RNA中的修饰存在性及比例，但此种方法并不能得知修饰在某段序列中的位置。因此，需借助其他手段，在核苷酸序列水平对修饰进行定位。基于质谱技术的核酸序列分析具有所需样品量少、准确性高、可同时分析多种类型核酸修饰的优势，适用于寡核苷酸序列中核酸修饰的准确定位；结合免疫共沉淀、限制性内切酶酶切法、逆转录测序、化学标记/转化法、纳米孔单分子测序和冷冻电子显微镜等技术，可实现全基因组和转录组水平中核酸修饰的破译，从而更加精准地揭示其表观遗传学功能［54］。

基于LC-MS/MS的序列分析对象通常为较短的RNA（如rRNA和tRNA等），或采用特异性核酸酶处理，以获得适宜LC-MS/MS分析的寡核苷酸片段，然后通过产物离子磷酸二酯键中P-O键的特征性裂解获得阶梯序列，拼接成含有修饰位点的寡核苷酸前体离子［55-56］。最常使用的RNA水解酶为RNA酶T1和RNA酶A，其中，RNA酶T1的断裂位点为鸟嘌呤，RNA酶A的断裂位点则为嘧啶类碱基［57-58］。结合使用多种RNA酶产生独特、互补的酶解产物，从而重构成完整的、涵盖修饰位点的寡核苷酸序列，获得最大的序列覆盖度［59］。因此，开发新类型的碱基特异性核酸酶是实现完整序列覆盖的关键。Addepalli课题组近年开发了多种新型RNA酶，包括RNA酶U2、RNA酶MC1和RNA酶cusativin，其识别的碱基分别为未修饰的腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶［60-62］。基于这种“自下而上”的LCMS/MS序列分析方法，已获得了真核及原核生物RNA中多个修饰位点，包括大肠杆菌（Escherichia coli）23 S rRNA中的3-甲基假尿嘧啶（3-methyl pseudouridine，m3Ψ）、mRNA中的m5U和Ψ，利什曼原虫（Leishmania tarentolae）线粒体tRNA中的2-巯基尿嘧啶（2-thiouridine，s2U），以及在枯草杆菌、植物及锥虫tRNA中均检测到的37位ms2ct6A（2-methylthio cyclic N6-threonylcarbamoyladenosine）［63-65］。此外，Rahimoff等［66］通过设计、合成探针，结合LC-MS/MS对脱碱基位点（abasic sites）及其中间产物β-消除位点产物进行定量，结合同位素标记核苷酸，可将中间产物溯源为最初的碱基形式。此种方法为序列中碱基切除修复的定位和定量分析提供了新思路。

相较于LC-MS/MS，“自上而下”MS法的优势在于无需进行酶解，可直接对完整核酸序列进行分析。目前已实现对植物miRNA末端2′-O-甲基化的鉴别［67］。此外，可对大肠杆菌tRNA中多种修饰进行定位，并获得tRNA的碰撞诱导解离谱图，序列覆盖度可达89%［68］。最近，“自上而下”MS 法又应用于RNA中多种修饰混合物（m6A，m5C，m3U和m5U）的分析中，揭示了其在异构化修饰鉴别中的作用［69］。然而，此方法对核酸样品的纯度要求很高，当前仅可用于RNA纯品的分析中，有待与生物样品处理新方法的结合应用。与稳定同位素修饰相结合，LC-MS/MS方法已应用于揭示修饰碱基的代谢途径及其在基因组、转录组中的状态，但缺陷在于仅能追溯特定结构核酸修饰，无法准确提供大规模的核酸序列信息。因此，当混入外源DNA等污染物时，会使其无法与相关基因组中的核苷区分，这种情况需要谨慎规避［14，43，70-71］。

基于质谱的测序技术可以应用于寡核苷酸序列中修饰位点的鉴定及同分异构体的区分。此外，也可在全基因组、转录组范围水平上，结合现有的多种高通量测序方法对修饰核苷酸进行定位。通过免疫共沉淀技术可对低丰度的核酸修饰进行富集，但该方法尚无法进行单碱基水平的定位，且需要特异性识别目标物的抗体［72］。化学反应介导的测序弥补了这一缺陷，可实现单碱基水平的全基因组修饰核苷酸定位，其中最经典的亚硫酸氢盐转化法可实现全基因组DNA甲基化的单碱基分辨分析。近年也应用于果蝇rRNA和tRNA及人mRNA中m5C的分析中［73-74］。但该方法必须基于高选择性的化学反应，且需不断进行条件优化，以避免核酸，特别是RNA的降解，这是当前的难点所在。

相较于化学反应介导测序，酶介导的测序方法处理条件温和，可进行直接分析，避免了大量核酸的降解。袁必锋课题组建立了AMD-seq测序法，利用胞嘧啶及其修饰在重组APOBEC3A酶结合作用下发生脱氨基反应，使胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）、5-mC转化为胸腺嘧啶（T），结合β-GT糖基化5-hmC（5-ghmC）的脱氨基抵抗作用，使处理后测序中C、5-mC读成“T”，5-hmC读成“C”，从而实现了DNA中5-hmC的单碱基分辨率分析［75］。目前适宜进行酶介导测序分析的核苷酸修饰种类并不多，但这种方法仍具有很大的应用潜力。当前主要的核酸序列分析方法比较见表3。

表3 核酸测序分析方法比较

2 LC-MS/MS技术在核酸表观遗传修饰研究中的应用

2.1 DNA甲基化及其氧化衍生物在基因组中的定位研究

研究表明，多种毒物诱发的疾病及人类癌症的发生均与TET双加氧酶的异常活性相关。Pfaffeneder等［70］以小鼠胚胎干细胞为模型，通过稳定同位素示踪结合定量质谱法研究发现，TET双加氧酶的氧化作用不仅局限于胞嘧啶，还可催化胸腺嘧啶氧化为5-羟甲基尿嘧啶（5-hydroxymethyluridine，5-hmU）。结合稳定同位素示踪及肽示踪的蛋白质相互作用实验进一步证明，TET双加氧酶的氧化作用与DNA的有效修复密切相关。DNA中嘧啶类和嘌呤类碱基上的甲基化修饰及其相关氧化关系如图1和图2所示。通过对哺乳动物DNA胞嘧啶的UPLC-MS检测，Bachman等［76］证实了5-hmC的体内稳定性，证明其本身也是一种表观遗传标记。上述结果均表明，DNA甲基化的动态、可逆调节机制在生物体内具有重要作用，5-mC及其氧化产物可作为环境毒物暴露的效应标志物及癌症预测和诊断的标志物。

图1 哺乳动物基因组中存在的DNA嘧啶类修饰及其转化关系.dC：脱氧胞苷；dT：脱氧胸苷；dU：脱氧尿苷；DNMT：DNA甲基转移酶；ROS：活性氧；TDG：胸腺嘧啶DNA糖基化酶；BER：碱基切除修复；5-hmdC：5-羟甲基脱氧胞苷；5-fodC：5-醛基脱氧胞苷；5-cadC：5-羧基脱氧胞苷；5-mdU：5-甲基脱氧尿苷；5-hmdU：5-羟甲基脱氧尿苷；5-fodU：5-醛基脱氧尿苷；5-cadU：5-羧基脱氧尿苷.

图2 哺乳动物基因组中存在的DNA嘌呤类修饰及其转化关系.dA：脱氧腺苷；dG：脱氧鸟苷；6-mdA：N6-甲基脱氧腺苷；5-mdC：5-甲基脱氧胞苷；6-hmdA：N6-羟甲基脱氧腺苷；6-fodA：N6-醛基脱氧腺苷；8-oxodG：8-氧代脱氧鸟苷；8-OH-dG：8-羟基脱氧鸟苷；8-oxoG：8-氧代鸟苷；8-OH-G：8-羟基鸟苷.

近年测序类研究结果显示，m5C在RNA中同样广泛存在，可鉴定出8000余个位点，并大量集中于非编码区及结合区域［77］，其氧化产物以hm5C为主，fo5C及ca5C含量极低［39，78-79］。此外，Xu等［80］和Ma等［81］近年在哺乳动物及人mRNA中发现，在类甲基转移酶-8（methyltransferase-like 8）催化作用下形成的3-甲基胞嘧啶（m3C），可在链内引入1个单位正电荷，导致RNA二级结构的变化，进而影响其与蛋白质的相互作用。

Schiffers等［14］近年提出了关于小鼠胚胎干细胞及基因组中6-mA存在性的质疑。针对这一问题，汪海林课题组建立了无污染UPLC-MS/MS方法，并通过酶解法完全释放6-mA，从而对哺乳动物细胞系DNA中6-mA进行超灵敏、精确定量检测，确证了6-mA在真核细胞中的存在性，且发现DNA中6-mA依赖于DNA聚合酶［82］。尽管不断有研究揭示6-mA存在于真核生物DNA中，但囿于其较低的体内丰度，具体功能机制仍尚未阐明，甚至在近年关于6-mA与肿瘤发生相关的研究中获得了相反的结果［13，83］，这说明仍需不断发展高灵敏检测技术，以证实其在真核生物DNA中的水平，并进一步研究其在生长发育过程中的功能。

2.2 多种新类型RNA修饰的发现和鉴定

m6A也是真核生物RNA中含量最丰富的修饰类型。近年研究表明，与m6A修饰过程相关的去甲基化酶ALKBH5可促进mRNA的出核转运过程，而降低m6A甲基化酶复合物METTL3的表达则会减缓mRNA从细胞核到细胞质的转运［84-85］。此外，与DNA中的6-mA修饰相同，FTO同样能介导RNA上m6A的连续氧化去甲基化过程，相继生成hm6A和N6-醛基腺嘌呤（N6-formyladenine，fo6A）［86-87］，表明mRNA上腺嘌呤甲基化也是动态的生理调控过程［5］。

m7G进化相对保守，通常存在于真核生物mRNA的5′帽子处，与前体mRNA的有效剪接、多聚腺苷酸化、出核运动及翻译等过程密切相关［88-89］。2018年，袁必锋课题组研究发现，m7G同样存在于其内部片段中，且在重金属暴露下mRNA中5′端、内部m7G的含量均会显著下调，揭示其作为环境毒物暴露效应标志物的潜能［90］。此外，m7G携带正电荷，可通过影响tRNA中碱基配对而改变其高级结构［91］。

Ψ普遍存在于RNA中，可增加tRNA和rRNA的稳定性。近年LC-MS/MS检测发现，Ψ同样存在于哺乳动物mRNA中，且经修饰Ψ/U比率为0.2%～0.6%，与m6A含量相当，可能具有增加遗传密码多样性、翻译调控的功能，并与mRNA的稳定性及定位相关［92-94］。此外，存在于rRNA上的Ψ修饰还可改变核糖体对mRNA的亲和力，从而影响特定mRNA的翻译起始过程［95］。

在所有类型RNA中，tRNA上的修饰密度最高、类型最多。其中，二氢尿嘧啶与Ψ和m1A等简单修饰普遍存在于所有类型的tRNA中，但其他较高级修饰则具有区域特异性，可视作一种进化的标志［96］。tRNA修饰是蛋白质合成的重要调控元件，细胞利用反密码子环及周围的tRNA修饰对有限合成的蛋白质类型进行选择性改变，进而通过影响密码子与反密码子间的亲和力，实现tRNA修饰对翻译过程的速度、精准度进行调控，以避免反密码子环松散或塌陷，造成移码错误［97］。

rRNA修饰参与RNA和蛋白质等生物大分子与多种小分子配体的相互作用，故具有相对保守的空间分布，集中在解码、tRNA结合位点、肽基转移酶中心及rRNA亚基界面等重要功能区域，故也参与核糖体功能调节，并可精细调节核糖体活性［98-99］。目前已在大肠杆菌中鉴定出36种修饰核苷［4］，真核rRNA上也鉴定出多个以2′-O-甲基化和Ψ为主要类型的多个修饰位点。例如，酿酒酵母rRNA中有55个2′-O-甲基化修饰位点和44个Ψ修饰位点。人rRNA中存在的200多个位点中，半数以上为2′-O-甲基化和Ψ［100］。2种修饰均可稳定RNA二级和三级结构，2′-O-甲基化修饰可增强碱基堆积力，从而起到稳定碱基对的作用［101］。目前已确定的核酸修饰功能见表4。

总之，转录组中的修饰核苷酸可影响RNA的结构，从而改变其与蛋白质间的亲和力，最终调控基因表达，使RNA-蛋白质相互作用网络多样化、复杂化。近年研究逐渐指向模板mRNA中修饰核苷酸对密码子的影响，最终体现在对翻译表达蛋白质的序列和高级结构的干扰［102］。由此表明，可基于“中心法则”这一主线，建立应用于修饰组学中的核酸修饰、蛋白质表达的LC-MS/MS新方法。

2.3 核酸修饰定量技术在表观遗传毒性研究中的应用

环境中有毒有害物质的暴露可诱发人体的多种生物代谢过程，如炎症、氧化应激、脂质过氧化、感染和肠道菌群转移等，从而在这些过程中生成异常代谢产物，并不断蓄积突变，控制细胞增殖、分化和凋亡过程，最终影响人类健康，诱发多种疾病。基于环境污染物致癌效应、神经退行性疾病等多重研究证据表明，多种退行性疾病的形成与生命体早期接触或暴露于环境污染物有关，可能是意外性接触或长期、低剂量职业性暴露的迟发作用后果。表观遗传学从基因的转录及转录后调控水平解释了机体接触或暴露污染环境后形成相对稳定特征性印迹的原因，也为化合物诱导的长期、跨代毒性效应的毒理机制研究提供了证据和新的视角。

当前研究已证实，外源性毒物接触可使机体形成稳定的表观遗传图谱，且具有毒物暴露特征性，可作为有效的暴露标志物。基于外源化学物暴露造成的机体表观遗传效应已逐渐发展为表观遗传毒理学这一新兴研究领域。目前已明确了几类具有表观遗传效应的毒性因子，包括金属、过氧化物酶体增殖物、空气污染物、内分泌干扰物等环境来源的化学物、饮食和生活习惯等个体差异性因素，也包括意外性接触或蓄意实施的新型、大规模杀伤性化学和生物武器［103］。关注外源化学物引起的表观遗传学变化及其可能产生的健康危害效应并针对特定从业人员的职业性暴露导致的表观遗传毒性机制研究，不仅对于人类风险评定、风险因子及相关材料接触的识别具有重要意义，也为潜在、新型核化生威胁的预警侦查提供了新的可能性［104］。理论上，表观特征标志物（episignatures）是机体暴露于复杂环境的“适应性重塑”，可实时反映机体中特定组织的健康状态，从而预判疾病的发生情况。通过比较环境化学物暴露后分子水平、细胞水平、组织水平及人群中的表观基因组轮廓，获得环境化学物的潜在表观遗传毒性效应，结合采用系统毒理学方法，可实现基于表观基因组轮廓的环境毒物筛选与早期预警，获得更完整的人类表观毒理学轮廓信息，形成改进后的高通量筛选策略［103］。

基于MS的分析可实现核酸修饰的整体水平准确定量，结合高通量测序技术，可在表观基因组及表观转录组水平获得不同类型环境毒物暴露的特征性轮廓，为相关的表观遗传毒理机制研究提供重要依据。随着单分子实时检测（single-molecule realtime detection）、纳米孔测序等第三代测序技术的发展，可获得更加全面、准确的核酸修饰变化图谱，以进一步揭示毒物的跨代、远期毒性效应，并从毒物诱导的表观遗传效应角度揭示毒物的“三致作用”（即致癌、致畸、致突变）分子机制［105-106］。此外，借助基于高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry）技术的“暴露组学”平台，可实现多种环境因素暴露后体内的外源化合物转化形式及内源性代谢产物的高通量、高灵敏监测；结合生物信息学数据挖掘技术的差异表达性分析，可模拟职业性接触、工业性接触、食品源接触等真实情况下机体暴露于复杂环境后的体内代谢，并通过核酸修饰，从表观遗传角度解释多重环境因素在体内的复杂累加效应［40，107］。

然而，表观遗传毒理学研究尚处于起步阶段，相关毒性分子机制研究及模型的验证方法尚不完善，尚未全面开展在人体水平的风险因子暴露类型和水平预警的具体应用［108］，其主要局限在于不同年龄、不同性别和不同生活习惯的群体及同一机体内所有组织和细胞类型的表观遗传印迹鲜有共性。尚未获得适宜作为对照组的表观基因组和表观转录组轮廓规律，无法建立适用于所有人群和不同类型样本统计学模型的统一标准。此外，当前的表观遗传效应多基于临床疾病的预后性研究，无法排除年龄、性别、个人生活习惯及自身健康状况等因素的影响，尚未实现将特征性的表观遗传效应直接与机体暴露的风险因子相关联。因此，如何将毒物暴露的细胞和动物模型外推至人体也是当前表观遗传风险预警应用面临的重要挑战。

3 结语和展望

近年关于新类型核酸修饰的定量及定位的研究极大促进了表观基因组学及表观转录组学的发展，高灵敏度、低成本的质谱分析技术已成为极低丰度核酸修饰研究的最佳研究手段之一，基于LCMS/MS技术的核酸修饰方法具有良好的实际应用性，已成为分析化学与生命科学、环境毒理学和药学的交叉研究热点。随着基因组学和转录组学研究的深入，小RNA和长链非编码RNA等特殊类型RNA逐渐成为近年的研究热点，但对其中的特殊核酸修饰类型及其对调控功能影响尚不够明确，需要新技术和新方法的进一步推动。

核酸修饰研究前景很大程度依赖于质谱技术的发展和进一步应用。首先，仍需改进核酸修饰的检测和分析技术，建立并优化核酸的在线酶解等高效样品前处理技术，以去除外源修饰核苷酸对目标物的干扰，并从核酸修饰的化学衍生化、特异性抗体捕获等角度发展灵敏度、选择性更佳的分析策略，改善当前测序技术中的假阳性现象。这些新技术的发展有助于核酸序列中修饰位点的准确识别和新类型核酸修饰的发现，有望作为毒理学研究中新的标志物，也可为蛋白质组学和代谢组学生命机制的研究提供新的线索。此外，亟需通过分析化学、生命科学、毒理学和生物信息学等学科交叉，发展基于质谱、高通量测序及计算表观遗传学的高灵敏度、高通量串联检测平台，更好地实现“表观修饰”这一稳定印迹在疾病诊断、风险评估和预警中的应用。