任禹珂，姜 华，张 頔，杨艳伟，王 超，张河战，李 波，林 志

（中国食品药品检定研究院，国家药物安全评价监测中心，药物非临床研究北京市重点实验室，北京 100176）

自磺胺嘧啶可诱导狼疮首次报道后，越来越多的药物被证明可干扰免疫系统并导致自身免疫性疾病，即药物诱导的自身免疫（drug-induced autoimmunity，DIA）［1］。药物诱导的自身免疫性疾病是一种长期用药引起的“B”型药物不良反应，已经有近百种药物和数十种疫苗可诱发自身免疫性疾病［2-3］。传统的可诱发狼疮症状的高风险药物普鲁卡因胺和肼苯哒嗪已逐渐退出市场。目前，药物诱导的狼疮与使用新的生物调节剂，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抑制剂和干扰素有关［2］。此外，药物诱导的免疫毒性，也是非临床药物研发失败以及临床发生不良反应的主要原因之一。尽管药物非临床安全性评价有针对药物免疫毒性评价相关指导原则ICH S8，但其并不包括药物诱导的自身免疫毒性，所以急需寻找能够在药物诱导的自身免疫毒性早期做出预测的有效生物标志物。抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是诊断自身免疫性疾病的主要指标，但未检测到ANA依旧不能排除发生DIA的可能性。此外，不同药物诱发的自身免疫性疾病产生的自身抗体也可能不同，如与普鲁卡因胺有关的自身抗体主要有抗组蛋白（H2A-H2B）-DNA抗体和抗心磷脂抗体［4］，与TNF-α抑制剂有关的自身抗体主要有ANA、抗双链DNA（double-stranded，dsDNA）抗体和抗核小体抗体等［5］，所以急需寻找更加可靠的药物诱导的免疫毒性的生物标志物。

大量研究表明，微RNA（microRNA，miRNA）表达的改变与免疫功能障碍和自身免疫高度相关，miRNA参与了多种自身免疫性疾病的发生和发展。miRNA存在于多种组织中，具有稳定性且易于检测［6］。因此，其具有作为自身免疫性疾病的生物标志物的可能性。本研究采用经典DIA模型［7］，BN大鼠ig给予D-青霉胺，在不同时间点解剖，提取脾组织中的RNA，选取与自身免疫性疾病相关的4种miRNA（miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p），利用茎环法RT-qPCR检测其在脾组织表达的改变，探讨miRNA作为DIA毒性生物标志物的可能性。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

D-青霉胺（货号A11446），美国Alfa Aesar公司；ANA ELISA检测试剂盒，美国Alpha Diagnostic International公司；Trizol总RNA提取试剂，天根生化科技（北京）有限公司；含基因组DNA（gDNA）Eraser PrimeScript™逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNase H Plus）、ROX plus和DL2000 DNA分子量标准，日本TaKaRa公司；4种miRNA引物（表1和表2），美国Invitrogen公司。LEICA ASP300脱水机、SAKURATecc4714自动包埋机、SAKURAIVS-410滑动切片机、SAKURA Tissue-TekDRS-2000全自动染色机和SAKURATissue-TekGLAS C410封片机，日本樱花检验仪器株式会社；SpectraMax PLUS384酶标仪，美国Molecular Devices公司；NANODROP 2000分光光度计，美国Thermoscientific公司；ABI7500荧光定量PCR仪，美国Applied biosystems公司。

Tab.1 Primer sequences of stem loop reverse transcription

Tab.2 Primer sequences of real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 实验动物

30只 SPF级雄性 Brown Norway（BN）大鼠（6周龄），体重110～140 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。大鼠饲养于SPF屏障系统，温度设定为20～25℃，相对湿度40%～70%，换气次数为15 h-1，照明时间为12 h·d-1（8∶00-20∶00），给药期间自由摄食和饮水。动物实验经中国食品药品检定研究院动物伦理委员会认证批准，实验操作符合《实验动物管理条例》等法规的要求。

1.3 动物分组和给药

经7 d检疫期观察后，30只BN大鼠按照体重随机分为3组，每组10只（给药7和14 d各解剖5只），分别为溶媒对照组、D-青霉胺150和450 mg·kg-1组，每天给药1次，溶媒对照组ig给予生理盐水。末次给药第2天处死大鼠。腹腔静脉采血，室温静置1 h后4℃，3220×g离心10 min，得血清，取上清稀释20倍。用ELISA法检测血清中ANA；取脾称重后进行组织病理学检查，剩余脾组织-80℃保存用于提取RNA。

1.4 症状观察、体重测定和脾系数计算

给药期间观察面部脱毛及耳朵发红等自身免疫反应。给药1，5，7，10和14 d测大鼠体重（g），给药7和14 d称脾重（g），计算脾系数。脾系数=脾重/体重×100。

1.5 HE染色观察脾组织病理改变

取1.3分组大鼠脾组织，在10%福尔马林中固定，脱水，包埋，切片（厚度约3 μm），经苏木精-伊红（HE）染色后封片，在光镜下进行病理学检查。

1.6 ELlSA测定血清ANA水平

取1.3分组制备的血清，按照试剂盒说明书检测血清ANA水平。使用酶标仪检测450 nm波长处吸光度（A）值。

1.7 脾组织中总RNA的提取

取1.3分组大鼠脾组织，加入液氮后研磨，加入Trizol剧烈震荡，室温放置5 min；加入氯仿涡旋混匀，室温放置5 min；12 000×g离心15 min后取上层水相，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀后在冰上静置10 min；12 000×g离心15 min，弃上清；用75%乙醇洗涤沉淀，4℃，12 000×g离心5 min，弃上清；室温晾干沉淀，加入无RNA酶双蒸水溶解沉淀得总RNA。总RNA样本A260nm/A280nm比值在1.8～2.1之间，变性琼脂糖凝胶电泳检测结果表明RNA完整。

1.8 RT-qPCR检测脾组织中miRNA表达

采用茎环法对总RNA进行逆转录，然后使用SYBR®Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus），ROX plus进行实时PCR反应。使用U6作为内参基因，采用Reverse Transcriptase M-MLV参照试剂说明书进行逆转录。逆转录产物cDNA进行实时荧光定量 PCR：2×SYBR® Premix Ex Taq™Ⅱ10 μL；正向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL，反向引物（10 μmol· L-1）0.5 μL；cDNA 2 μL；无 RNA 酶 水7 μL。ABI7500荧光定量PCR仪检测程序：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，40 s，循环40次。扩增反应结束后，按0.05℃·s-1从60℃缓慢加热到99℃，建立PCR产物的熔解曲线，根据熔解曲线比较扩增产物的特异性，数据采用2-△△Ct法进行分析。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 D-青霉胺大鼠自身免疫症状及体重和脾系数的变化

连续给药第6天，D-青霉胺450 mg·kg-1组3/10大鼠开始出现耳缘结痂症状，第8天3/5大鼠出现耳缘结痂症状；150 mg·kg-1组第6天1/10大鼠开始出现耳缘结痂症状，第8天2/5大鼠有耳缘结痂症状。该症状为自身免疫病症状（图1A）。给药期间各组大鼠的体重均保持增长趋势，与溶媒对照组相比给药组无明显变化（图1B）。与溶媒对照组相比，给药7 d后D-青霉胺150 mg·kg-1组大鼠脾系数显著升高（P＜0.05），给药14 d后450 mg·kg-1组脾系数显著升高（P＜0.05）（图1C）。

Fig.1 D-penicillamine-induced autoimmune manifestations（A）and changes of body mass（B）and spleen coefficient（C）.Brown Norway（BN）rats were ig administrated D-penicillamine 150 and 450 mg·kg-1once daily for 7 and 14 d，respectively，and were weighed on 1，5，7，10 and 14 d after administration.Spleen coefficint=spleen mass（g）/body mass（g）×100.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with solvent control group.

2.2 D-青霉胺致大鼠脾组织病理改变

HE染色显示（图2），给药7 d后，D-青霉胺150 mg·kg-1组大鼠脾组织发生极轻度生发中心活跃伴易染体巨噬细胞数目增多，450 mg·kg-1组脾组织发生极轻度至轻度生发中心活跃伴易染体巨噬细胞数目增多。给药14 d后，D-青霉胺150 mg·kg-1组脾组织发生极轻度至轻度生发中心活跃伴易染体巨噬细胞数目增多，450 mg·kg-1组脾组织发生轻度至中度生发中心活跃伴易染体巨噬细胞数目增多。溶媒对照组大鼠脾组织未见病理改变。

Fig.2 Spleen histopathological changes in BN rats after 7 and 14 d of D-penicillamine administration（HE staining，×4）.See Fig.1 for the rat treatment.Arrows show active germinal centers with increased numbers of tingible body macrophages.

2.3 D-青霉胺对大鼠血清ANA水平的影响

给药7 d后，与溶媒对照组相比，D-青霉胺2个剂量组血清ANA水平无明显变化；给药14 d后，D-青霉胺450 mg·kg-1组血清ANA水平显著升高（P＜0.05）（图3）。

Fig.3 Effect of D-penicillamine on serum levels of antinuclear antibody（ANA）in BN rats after 7 and 14 d of administration.See Fig.1 for rat treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with solvent control group.

2.4 D-青霉胺对大鼠脾组织miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p表达的影响

由表3所示，给药7和14 d后，与溶媒对照组相比，D-青霉胺150和450 mg·kg-1组大鼠脾组织miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p表达均显著升高（P＜0.01）；与D-青霉胺150 mg·kg-1比较，450 mg·kg-1组脾组织4种miRNA表达亦明显升高（P＜0.01），其中miR-155-5p升高更为明显。给药14 d与给药7 d相比，D-青霉胺150和450 mg·kg-1组大鼠脾组织4种miRNA表达明显升高（P＜0.01）。此外，D-青霉胺给药7 d后，传统的血清标志物ANA并未明显升高。

Tab.3 Effect of D-penicillamine on expression of miR-126a-5p,miR-155-5p,miR-146a-5p and miR-27a-3p in rat spleen tissue

2.5 大鼠脾组织miRNA与血清ANA水平受试者操作特征曲线（receiver operating curve，ROC）分析

对给药7和14 d 2个时间点所有大鼠的血清ANA和脾组织miRNA的检测数据进行ROC分析，以脾组织发生病理改变为标准，出现病理损伤者为阳性大鼠（标记为“1”），未出现病理损伤者为阴性大鼠（标记为“0”），通过ROC曲线下面积（AUC）评价传统指标ANA和miRNA的预测价值。ANA和miRNA的ROC曲线和AUC如图4和表4所示。

Fig.4 Receiver operating curve(ROC)of ANA,miR-126a-5p,miR-155-5p and miR-146a-5p,miR-27a-3p.See Fig1.for the rat treatment.ROC curves of ANA and miRNA were drawn by SPSS17.0.

Tab.4 Area under curves(AUCs)of ANA and miRNA in spleens of rats administered with D-penicillamine

表4结果表明，4种miRNA的AUC均大于ANA，且miR-126a-5p的敏感性和特异性均高于ANA，miR-27a-3p和miR-155-5p的敏感性高于ANA，miR-146a-5p的特异性高于ANA。

3 讨论

本研究结果表明，BN大鼠ig给予D-青霉胺14 d后，脾系数显著增加，血清ANA水平显著升高，病理学检查见脾白髓生发中心活跃伴易染体巨噬细胞数目增多。由此表明，D-青霉胺可诱发BN大鼠产生类狼疮样自身免疫性疾病。

本研究结果显示，传统的自身免疫毒性生物标志物血清ANA的水平在ig给予D-青霉胺14 d后才开始升高，而大鼠脾组织miR-126a-5p，miR-146a-3p，miR-27a-3p和miR-155-5p在ig给予D-青霉胺7 d后即显著升高，升高程度均高于ANA，表明这4种miRNA作为药物诱导的自身免疫毒性生物标志物的敏感性高于血清ANA。对miRNA和ANA的ROC曲线分析结果表明，4种miRNA的AUC均大于ANA，即预测价值高于ANA。因此，在非临床安全性评价研究中，该4种miRNA可能是较ANA更好的药物诱导自身免疫毒性的生物标志物。

miRNA是一种内源性、长度约为22个核苷酸的非编码RNA，它们可通过碱基互补配对与靶mRNA的3′端非翻译区结合，抑制翻译或使靶mRNA降解，从而在转录后水平调节基因表达［8］。已有研究表明，miRNA调控的改变似乎与免疫功能紊乱和自身免疫反应的发生密切相关，不同的miRNA表达谱被认为是某些自身免疫性疾病的生物标志物［9］。脾是药物诱导的免疫毒性损伤的主要靶器官，且在非临床药物安全性研究中易于获得。通过检测脾和血液中miRNA的表达，发现脾中miRNA表达的改变更显著，所以在药物诱导的自身免疫动物模型中，脾miRNA是更好的研究目标［10］。其中，miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p在多种自身免疫性疾病中的表达均发生了改变。miR-155可以通过作用于细胞信号阻抑物1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）促进白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）诱导的信号转导、转录激活因子5（activation of signal transducer and activator transcription 5，STAT5）信号转导和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的分化，而Treg中miR-155表达的变化可能导致自身免疫性疾病的发生［11］。miR-146a则通过靶向干扰素（interferon，IFN）调节因子5，SOCS1，STAT1，IL-1受体相关激酶1和肿瘤坏死因子受体相关因子6负调节Ⅰ型IFN信号通路，从而参与自身免疫性疾病的病理过程［12］，而miR-27a可能通过作用于胱天蛋白酶8和IL-10等基因mRNA促进自身免疫性疾病的发生［13］。目前，有研究表明，miRNA与DNA甲基化相互作用可以使T细胞高度活化从而诱发自身免疫，CD4+T细胞中miR-126a可以通过抑制DNA甲基化转移酶1使DNA低甲基化，从而诱发系统性红斑狼疮［14］。总之，miRNA的异常表达可能参与药物诱导的自身免疫毒性的发生和发展过程。

综上所述，在药物诱导的自身免疫毒性研究中，脾组织miR-126a-5p，miR-146a-3p，miR-27a-3p和miR-155-5p与自身性疾病的发生密切相关，且敏感性优于传统的自身免疫性疾病生物标志物ANA，同时该4种miRNA的预测价值均高于ANA。以上结果提示，miRNA有可能成为早期诊断药源性自身免疫毒性的生物标志物。此外，关于miRNA预测药源性自身免疫性疾病的特异性以及参与调控药源性自身免疫毒性的作用机制还有待深入研究。