张金霞，刘伟江，苏菲娅，张 晗，于丰实，白海涛，袁福临，刘元林，李 雪，王 洋，郑荣秀，张 毅

（1.天津医科大学总医院儿科，天津 300052；2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是由胰岛β细胞被免疫性破坏导致胰岛素分泌不足引起的一种高血糖及糖代谢异常的免疫性疾病［1］。根据国际糖尿病联合会的最新研究报告指出，患有T1DM的儿童和青少年（0～19岁）已达110万，成为威胁世界各国儿童健康的新问题［2］。目前，T1DM仍以注射外源性胰岛素替代疗法为主，并不能阻止和修复破坏的胰岛细胞［3-4］，迫切需要研发新的治疗方法。因此，修复和再生胰岛细胞成为治疗的关键。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一类能够自我更新并可分化为多种功能细胞的成体干细胞，可从多种组织中获得，包括骨髓、脂肪组织和脐带等［5-6］。MSC具有免疫调节特性和再生胰岛素细胞的能力，对糖尿病患者展现出良好的治疗潜力［7］。在动物实验和临床试验中，静脉注射同种异体脐带或骨髓来源的MSC，可有效改善胰腺β细胞的功能，有些患者可出现短期的血糖正常、脱离胰岛素治疗的现象［8-12］。由于脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSC）具有易获取、来源丰富、低免疫原性及免疫调节等生物学特性和作用成为MSC临床应用的理想种子细胞［13-15］。T1DM患者糖代谢异常导致明显的消瘦，体重减轻；自身免疫反应导致抗炎因子增多，体内微环境改变。而ADSC作为脂肪组织微环境的主要细胞成分之一，在维持细胞环境稳态和调控脂肪前体细胞分化和成熟过程中发挥重要作用。因此推测，ADSC可能影响T1DM的发展及脂肪形成，但尚未见相关研究报道。本研究制备幼龄T1DM小鼠模型，观察其ADSC的成脂和成骨分化能力，为揭示T1DM患者消瘦的原因及阐明T1DM发病机制提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

20只3周龄雄性 C57BL/6J小鼠，体重9.5～10.5 g，北京斯贝福实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK-（京）2019-0010，饲养于军事医学研究院实验动物中心，12 h昼夜交替，环境温度22～25℃，相对湿度为35%～50%。所有动物实验过程均经军事医学研究院实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂和主要仪器

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、油红O、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛、维生素C磷酸盐、β-磷酸甘油和碱性磷酸酶，美国Sigma公司；Ⅱ型胶原酶、丙酮酸、柠檬酸、柠檬酸三钠和4%多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；α-MEM、0.25%胰酶、PBS缓冲液、胎牛血清和Trizol试剂，美国Gibco公司；兔抗小鼠胰岛素单抗，美国Abcam公司；流式抗体〔FITC标记抗小鼠CD11b，Sca-1，CD34和CD45抗体；PE标记抗小鼠CD90、主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）、CD31和CD29抗体〕，美国ThermoFisher公司；RTase M-MLV、RNA酶抑制剂及5×RTase M-MLV缓冲液，日本TaKaRa公司；DTT、dNTP、无RNA酶水和2×Mltra Master Mix，中国康为世纪有限公司；实时荧光定量PCR（RT-PCR）引物由上海生工生物有限公司合成（表1）。稳择易型血糖仪和稳择易型血糖试纸，美国强生公司；低温冷冻离心机、Qubit®2.0荧光定量仪和7500实时荧光定量PCR仪，美国 Thermo Fisher公司；流式细胞仪Facscalibur，美国BD公司；倒置相差显微镜和正置显微镜，日本Nikon公司。

Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.3 幼龄T1DM小鼠模型的制备和鉴定

取20只SPF级3周龄C57BL/6J雄性小鼠，适应性喂养3 d。随机分为T1DM模型组和正常对照组，每组10只。T1DM模型组连续5 d ip给予STZ 50 mg·kg-1，7 d后连续3 d尾静脉取血，检测空腹随机血糖，以随机血糖均值≥16.7 mmol·L-1为建模成功。正常对照组ip给予等体积柠檬酸缓冲液。造模成功后14，21和28 d分别检测空腹随机血糖和体重变化，14 d后取胰腺组织进行石蜡切片，固定后进行HE染色显微镜下观察胰腺组织的病理改变。免疫组织化学法检测胰腺组织胰岛素水平，胰岛素水平用阳性染色积分吸光度值表示。

1.4 幼龄T1DM模型小鼠ADSC的分离和培养

建模成功14 d后，脱颈处死正常对照组和T1DM模型组小鼠，无菌条件下取腹股沟和性腺周围的脂肪组织，胶原酶消化法制备ADSC，用α-MEM培养基37℃，5%CO2孵育。每2～3 d换液，直至细胞汇合达80%～90%时传代。

1.5 细胞形态观察和细胞表面标志物测定

将T1DM模型组和正常对照组小鼠ADSC原代培养至第2～5天，倒置显微镜观察细胞形态；培养至第3代（P3代）时，倒置显微镜和Giemsa染色观察细胞生长状态。

选用P3代细胞用流式细胞术检测细胞表面标志物。所用流式抗体为FITC-抗小鼠CD11b、PE-抗小鼠 CD31、FITC-抗小鼠CD34、PE-抗小鼠CD29、FITC-抗小鼠CD45、PE-抗小鼠MHCⅡ、FITC-抗小鼠Sca-1和PE-抗小鼠CD90单抗，抗体稀释比和操作步骤同抗体说明书。

1.6 体外诱导成骨分化能力的测定

选来源于T1DM模型组和正常对照组小鼠P3代ADSC，胰酶消化、离心后，以每孔3×104细胞密度接种于6孔板，设自分化（未诱导）组和成骨诱导分化组。待细胞贴壁24 h后，成骨诱导分化组更换为成骨诱导液。成骨诱导分化体系为β-磷酸甘油10 mmol·L-1、地塞米松 0.1 μmol·L-1和维生素 C 磷酸盐50 μmol·L-1，诱导7～14 d。诱导7 d后碱性磷酸酶染色，PBS清洗后丙酮固定，室温避光孵育30 min，PBS洗涤终止显色反应。蓝紫色增加表明碱性磷酸酶活性增强，ADSC成骨分化能力增强。实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测成骨分化关键转录因子Ost和Runx2 mRNA表达。

1.7 体外诱导成脂分化能力的测定

选来源于T1DM模型组和正常对照组小鼠P3代ADSC，胰酶消化、离心后，接种于6孔板，自分化（未诱导）组和成脂诱导分化组分别以每孔2×104和1×105细胞密度接种于6孔板内。24 h细胞贴壁后，成脂诱导分化组更换为成脂诱导液。成脂诱导分化体系为吲哚美辛0.5 mmol·L-1、胰岛素10 μg·L-1、地塞米松1 μmol·L-1和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol·L-1。诱导9 d后，多聚甲醛固定，油红O染色，显微镜观察细胞内脂滴数量。RT-PCR检测成脂分化关键转录因子CEBPα和PPARγ mRNA表达。

对公共图书馆招聘信息中的其他需求进行词频可视化的结果显示，公共图书馆的其他招聘要求主要集中于考核方式和限制条件（见图5）。由于公共图书馆的招聘面向群体更广，自主权更大，因此一些省份对应届生和社会人员的招聘分开进行，沿海省份如广东、上海、福建、辽宁、天津等地对于非应届生有户籍限制。公共图书馆更青睐职称较高的馆员，对具有中级和副高级职称的非应届生实行优先录取政策，说明公共图书馆更加注重应聘者的工作经验。

1.8 RT-PCR检测成骨和成脂分化相关基因mRNA表达

Trizol法提取各组细胞的总mRNA，取1 μg定量逆转录生成 cDNA，RT-PCR检测CEBPα和PPARγ及Ost和Runx2 mRNA表达。反应体系：cDNA 1 μL，PCR 上下游引物（10 μmol·L-1）1 μL，RT-PCR Master Mix 10 μL和无RNA酶水8 μL；反应条件：95℃ 10 min，（95℃ 15 s，60℃ 1 min）40个循环，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s。GAPDH为内参基因，采用2-△Ct表示待测基因mRNA表达水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 幼龄T1DM小鼠模型的鉴定

图1结果显示，与正常对照组相比，T1DM模型组小鼠出现明显的多饮、多尿、多食等症状，外观毛发暗淡无光泽，体型消瘦（图1A），且体重增长显著低于正常对照组（P＜0.05，图1B）；血糖水平显著高于正常对照组（P＜0.05，图1C），随机血糖≥16.7 mmol·L-1。表明幼龄T1DM小鼠模型制备成功。

Fig.1 General physiological status（A），body mass（B）and blood glucose concentration（C）of streptozotocin（STZ）-induced young type 1 diabetes mellitus（T1DM）model mice.T1DM model was induced in three-week-old male C57BL/6 mice using STZ 50 mg·kg-1ip via tail vein for 5 d，and body mass and blood glucose were tested at 14，21 and 28 d，respectively.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 幼龄T1DM模型小鼠胰腺组织病理改变

HE染色结果（图2A1）表明，正常对照组胰岛组织结构完整；T1DM模型组胰岛组织结构基本被破坏，依稀可见形态不规则的残存结构，胰岛面积显著小于正常对照组（P＜0.01）（图2A2）。免疫组织化学法检测结果（图2B1）显示，T1DM模型组胰岛组织结构破坏严重，胰岛素免疫阳性反应较正常对照组降低，表明胰岛素分泌明显减少（P＜0.01）（图2B2）。提示经STZ诱导后小鼠胰腺组织发生糖尿病典型的病理改变，进一步表明幼龄T1DM小鼠模型制备成功。

Fig.2 Pathological changes of pancreas in STZ-induced young T1DM model mice at 28 d.See Fig.1 for the mouse treatment.A1：HE staining，the arrows show islet tissue；A2：the area of islet cells，semi-quantitative results of A1；B1：immunohistochemical staining，the arrows show insulin secretion；B2：insulin content，semi-quantitative results of B1.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 幼龄T1DM模型小鼠ADSC的鉴定

2.3.1 ADSC细胞形态和细胞表面标志物

Fig.3 Morphology（A and B）and phenotype（C and D）of adipogenic stem cells（ADSCs）from young T1DM mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A1 and B1：ADSCs digested by collagenase and amplified to the passage 3 in vitro；A2 and B2：cell morphology after Giemsa staining.

2.3.2 ADSC体外诱导成骨和成脂分化能力

分离培养的幼龄T1DM模型和正常对照组小鼠ADSC，经体外成骨诱导分化后，自分化（未诱导）组无碱性磷酸酶着色，而诱导组出现大量蓝紫色（图4A），提示ADSC碱性磷酸酶活性增强，具有成骨分化能力；RT-PCR结果显示，诱导组ADSC Runx2和Ost mRNA表达较自分化组均显著增加（P＜0.01）（图4C）。采用油红O染色检测结果显示，成脂诱导组ADSC出现大量红色花环样脂滴，脂滴融合为串珠样，充满整个视野，而自分化组几乎无脂滴（图4B）；RT-PCR结果显示，诱导组ADSC PPARγ和CEBPα mRNA表达较自分化组亦显著增加（P＜0.01）（图4D）。以上结果表明，分离培养的ADSC具有多向分化能力。

Fig.4 In vitro differentiation ability of ADSCs derived from young T1DM model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：osteogenic differentiation examined by alkaline phosphatase staining；B：adipocyte formation examined by Oil Red O staining；C：the key transcription factor expression during osteogenic differentiation detected by RT-PCR；D：the key transcription factors expression during adipogenic differentiation detected by RT-PCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding control（self differentiation）group.

2.4 幼龄T1DM模型小鼠ADSC成脂分化能力增高

进一步比较正常对照组幼龄小鼠和幼龄T1DM模型小鼠ADSC体外成脂分化能力。油红O染色结果显示，2组细胞经体外成脂诱导分化5 d，细胞内可见脂滴形成（图略）。诱导分化第9天正常幼龄小鼠和T1DM模型小鼠自分化组均无脂滴出现（图5A，数据略），但正常幼龄小鼠和T1DM幼龄小鼠诱导组均可见较多红色脂滴，且T1DM模型组红色脂滴大且聚集融合（图5A），脂滴数亦显著多于正常诱导组（P＜0.01）（图5B）。

Fig.5 Difference in adipogenic differentiation of ADSCs in vitro between normal young mice and young mice with T1DM detected by Oil Red O staining.See Fig.1 for the mouse treatment.A：adipogenic differentiation；B：number of lipid droplets after adipogenic differentiation.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

RT-PCR结果（图6）表明，正常对照组幼龄小鼠和幼龄T1DM模型小鼠ADSC成脂诱导后，PPARγ和CEBPα mRNA表达从第6天起开始升高（P＜0.01），直至诱导结束第12天，T1DM模型诱导组ADSC PPARγ和CEBPα mRNA表达均显著高于正常诱导组（P＜0.01）。上述结果表明，T1DM模型小鼠ADSC的成脂分化能力显著高于正常幼龄小鼠ADSC。

Fig.6 Difference in key transcription factors PPAR γ（A）and CEBP α（B）mRNA expressions in vitro between normal young mice and young mice with T1DM during induction of adipogenic differentiation of ADSCs by RT-PCR.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding self differentiation group；##P＜0.01，compared with corresponding adipogenic differentiation group.

3 讨论

ADSC是指存在于脂肪组织中具有自我更新和多向分化潜能的成体MSC。ADSC因其具有来源广泛、体内含量多、免疫原性低、分离提取时对机体创伤小等优点，使ADSC具有广阔的临床应用前景［13］。有研究表明，ADSC可提高糖尿病患者胰岛素及C肽水平，有效降低糖化血红蛋白水平［16-17］。但因T1DM个体长期处于高血糖环境，且晚期糖基化终末物和活性氧及酮体等物质增多，这些因素是否对自身ADSC数量以及增殖能力等生物学功能产生影响目前尚不清楚，

为此，本研究利用幼龄小鼠T1DM模型，探讨T1DM小鼠ADSC生物学特性是否发生改变，为阐明T1DM发病机制提供实验依据。本研究通过连续小剂量ip给予STZ成功构建3周幼龄小鼠T1DM模型，成模后提取T1DM小鼠皮下脂肪和性腺周围脂肪，分离培养ADSC。结果表明，幼龄T1DM小鼠ADSC的细胞形态呈成纤维样、贴壁生长，与正常幼龄小鼠ADSC相似。经传代后，流式细胞仪检测其细胞表型，结果显示均高表达CD29，CD90和Sca-1，不表达或低表达 CD31，CD45，CD34，CD11b和MHC Ⅱ，提示培养的T1DM小鼠ADSC其细胞表型与正常幼龄小鼠ADSC亦无差异。进一步对幼龄T1DM小鼠ADSC进行成脂和成骨的诱导分化。结果表明，其具有成脂和成骨的分化能力，油红O染色和碱性磷酸酶染色均呈阳性，且相关成脂和成骨分化的关键转录因子PPARγ和CEBPα及Runx2和Ost mRNA表达均显著增高。上述结果表明，幼龄T1DM模型小鼠即使出现明显消瘦，但在其脂肪组织中仍存在一定数量ADSC，并且成脂分化能力增强可能补充了体内消耗的脂肪，从而维持机体代谢平衡，这为研究T1DM患者脂代谢提供了理论依据。

本研究发现，幼龄T1DM模型小鼠ADSC成脂分化能力较正常对照组小鼠ADSC显著增强，油红O染色脂滴数量明显增多，且细胞内脂滴增大；T1DM模型组ADSC成脂分化关键转录因子PPARγ和CEBPα mRNA表达水平亦显著高于正常对照组，提示T1DM模型小鼠ADSC更易分化为脂肪细胞。T1DM患者发病后多表现为体质消瘦，胰岛破坏，胰岛素分泌不足，导致机体不能充分利用葡萄糖产生能量，使脂肪消耗增加，脂肪细胞体积减少。

目前针对T1DM患者ADSC成脂分化能力增强的作用机制尚不清楚。以往研究结果表明，体外高糖环境和晚期糖基化终末产物增多，引起氧化应激及慢性炎症，使ADSC成骨分化能力降低，成脂能力增强［18-19］。Pourgholaminejad等［20］报道，炎性因子可显著提高ADSC的成脂分化能力。而T1DM作为一个慢性炎症性疾病，是否由于患者体内的炎症反应导致ADSC脂肪分化能力增强以维持体内脂肪代谢平衡，尚需深入探讨。