鲍桃香，宋皓月，杨 涵，何春燕，舒 文，陈雯静，汤 荣，刘庆中

（上海交通大学附属第一人民医院，上海 201620）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人类各种感染的主要病原体，其致病机制和致病力与细菌产生的各种毒力因子密切相关[1]。这些毒力因子的表达（如胞外毒素、胞外酶、生物膜相关分子）很多都由群体感应附属基因调节子（accessory gene regulator，agr）系统调控，使细菌可以逃避机体防御，在感染部位播散，损伤组织[2]。

agr操纵子由被P2和P3启动子驱动的2个双向转录单元组成。P2启动子转录生成RNAⅡ分子，编码AgrB、AgrD、AgrC和AgrA 4种蛋白。AgrD和AgrB协作产生agr信号分子——自诱导肽（autoinduced peptide，AIP）。AIP与AgrC结合后可磷酸化AgrA，继而激活P2和P3[2]。P3启动子转录生成RNAⅢ，是agr系统调节多种毒力因子表达的胞内效应器，同时也是编码δ溶血素的基因。因此，检测菌株δ溶血情况可以评估agr功能。

agr基因座在金黄色葡萄球菌中分布广泛。但近几年的研究发现有临床分离的金黄色葡萄球菌中存在agr功能缺陷[3]。agr功能缺陷与生物膜形成、菌血症、慢性感染、预后不良和万古霉素耐药有关[3]。虽然agr功能缺陷在金黄色葡萄球菌感染中发挥重要作用，但关于其在我国临床菌株中流行情况的报道非常少。因此，本研究对上海市和浙江省共5家医院临床分离的1 238株金黄色葡萄球菌进行agr功能缺陷检测，并对功能缺陷菌株进行agr分型、金黄色葡萄球菌蛋白A基因（staphylococcal protein A，spa）分型、葡萄球菌盒式染色体mec（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）分型和多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST），以了解其流行情况和遗传学背景。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集上海市和浙江省5家医院分离自各种临床样本的非重复金黄色葡萄球菌1 238株，其中上海交通大学附属第一人民医院955株（2013年1月—2017年12月）、上海交通大学附属瑞金医院85株（2011年6月—2011年12月）、上海中医药大学附属曙光医院37株（2013年2月—2014年9月）、丽水市人民医院72株（2013年7月—2014年9月）、上海市第六人民医院89株（2010年12月—2014年9月）。药物敏感性试验质控菌株金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）由上海市临床检验中心提供。金黄色葡萄球菌RN 4220由复旦大学附属华山医院抗生素研究所惠赠。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinresistant Staphylococcus aureus，MRSA）NCTC 10442、N315、85/2082、JCSC4744和D12分别为SCCmecⅠ～Ⅴ型的参考菌株，由上海交通大学附属瑞金医院临床微生物科惠赠。

1.2 仪器与试剂

VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统（法国生物梅里埃公司）和配套革兰阳性菌鉴定卡；头孢西丁纸片（30 μg）购自英国Oxoid公司；血平板和水解酪蛋白培养基购自上海科马嘉微生物技术有限公司；引物合成、Taq酶、dNTPs、琼脂糖及溶葡球菌酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、GeneGreen核酸染料购自北京天根生物技术有限公司；DNA Marker购自大连TaKaRa生物工程有限公司；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）产物测序交由上海迈普生物科技有限公司完成。

1.3 细菌分离鉴定和甲氧西林药物敏感性试验

根据第4版《全国临床检验操作规程》[4]要求进行细菌培养和分离，采用VITEK2 Compact全自动微生物鉴定系统鉴定金黄色葡萄球菌。采用头孢西丁纸片法[5]检测金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。

1.4 agr功能缺陷菌株筛选

将待测菌株与只产生β溶血的金黄色葡萄球菌RN 4220垂直接种在血平板上，35 °C培养18～20 h。以在与金黄色葡萄球菌RN 4220交界处出现溶血增强为δ溶血阳性，提示agr功能正常；如果没有δ溶血活性，则为agr功能缺陷[6]。

1.5 DNA提取

在agr功能缺陷金黄色葡萄球菌菌液中加入10 μL溶葡球菌酶（浓度为1 mg/mL），37 °C孵育0.5 h后，按试剂盒说明书要求提取DNA，作为后续PCR的模板。

1.6 甲氧西林耐药性确认

对agr功能缺陷金黄色葡萄球菌行mecA和mecC基因检测，进一步确认其甲氧西林耐药性[7]。

1.7 agr、spa、SCCmec和MLST检测

参考文献[7-8]，采用PCR对agr功能缺陷金黄色葡萄球菌进行agr（agr1～4型）、spa、SCCmec（SCCmecⅠ～Ⅴ型）和MLST分型检测，引物见表1。spa基因可变重复区产物测序后通过RidomSpaServer数据库（http：//www.ridom.de/spaserver/）确定spa型别。对目的菌株7个管家基因arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL进行扩增和测序后，再进行MLST分型（http：//www.mlst.net），并应用eBURST v3软件分析菌株所属的克隆复合物（clonal complex，CC）。

表1 基因分型引物

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。分类变量的比较采用χ2检验或Fisher精确检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 agr功能缺陷金黄色葡萄球菌的流行特征

1 238株金黄色葡萄球菌中，72.8%（901/1 238）分离自呼吸道样本，14.6%（181/1 238）分离自脓液或分泌物样本，7.5%（93/1 238）分离自尿液样本，1.5%（18/1 238）分离自血液样本，1.1%（13/1 238）分离自导管引流液样本，1.4%（17/1 238）分离自其他无菌体液样本。头孢西丁药物敏感性试验结果显示，有565株（45.6%）为MRSA、673株（54.4%）为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）。δ溶血检测结果显示，有45株（3.6%）agr功能缺陷（δ溶血阴性）菌株（图1），包括28株（5.0%）MRSA和17株（2.5%）MSSA（χ2=5.177，P=0.023）。45株agr功能缺陷菌株中，37株（82.2%）分离自脓液/分泌物（19株）样本和呼吸道样本（18株），其余分离自尿液、导管引流液和无菌体液样本；患者以成年人为主，仅2株分离自儿童患者（6岁和11岁）。见表2。

表2 45株agr功能缺陷金黄色葡萄球菌的来源和遗传特征

图1 δ溶血活性检测结果

2.2 基因分型

agr分型以1型（44%，20/45）为主，其次为2型（33%，15/45）和3型（11%，5/45）。另有5株未能分型。agr1型在MSSA（58.8%，10/17）和MRSA（35.7%，10/28）间的分布

差异无统计学意义（χ2=2.288，P=0.130）；而agr2型在MRSA中所占比例（46.4%，13/28）显著高于MSSA（11.8%，2/17）（χ2=4.266，P=0.039）。

SCCmec分型结果显示，SCCmecⅡ最常见（71.4%，20/28），其次为SCCmecⅢ（25.0%，7/28），有1株细菌未能分型。未发现SCCmecⅠ、Ⅳ和Ⅴ型菌株。

spa可变重复区序列分析发现了20个spa型别。在MRSA中，最常见的为t002（21.4%，6/28），其次是t2460、t037和t311（各占17.9%，5/28）。其他spa型别分别为t030（2株）、t189、t2932、 t4549、 t007、 t010（各1株）。MSSA以t189型（29.4%，5/17）最为流行，其他12株分别为t3622（2株）和t091、t4362、t437、t2932、t338、t318、t6497、t11270、t502和t346（各1株）。仅有t189和t2932共存于MRSA和MSSA中（每个型别各1株）。

MLST结果显示，45株agr功能缺陷金黄色葡萄球菌分为10个型别，分别为ST7（CC7）、ST5（CC5）、ST239（CC8）、ST188（CC1）、ST88（CC88）、ST30（CC30）、ST59（CC59）、ST2114（CC6）、ST39（CC30）和ST15（CC15）。其中ST5（40.0%，18/45）和ST239（17.7%，8/45）是最主要的型别，且主要分布于MRSA[60.7%（17/28）和28.6%（8/28）]。居第3位的为ST188（13.3%，6/45），主要分布于MSSA（29.4%，5/17）。结合agr分型结果进一步分析，发现CC5是agr2分型中最为常见的CC（93.3%，14/15），而CC8主要存在于agr1分型（40%，8/20）。agr功能缺陷金黄色葡萄球菌的各种分子分型特征见表2。

表3 45株agr功能缺陷金黄色葡萄球菌基因分型总结

3 讨论

以往研究认为，agr功能缺陷金黄色葡萄球菌（尤其是MRSA）在临床上比较常见。而本研究结果显示该类菌株的流行率较低（3.6%），其与我国儿童人群中的流行率（3.71%）[3]基本一致；不同之处在于，本研究agr功能缺陷在MRSA中所占比例（5.0%）显著高于MSSA（2.5%）（P=0.023），而在YANG等[3]的研究中，儿童分离株中两者的比例相近，分别为3.79%和3.45%。FOWLER等[9]和SCHWEIZER等[10]认为，agr功能缺陷与血流感染及预后不良有关。不过，本研究并未从血液培养样本中分离出agr功能缺陷菌株。因此，agr功能缺陷与血流感染的相关性仍有待进一步探讨，或是对更多的血流感染样本进行研究。

agr型别会因地域、CC分布、毒力、耐药及AIP特性而不同[2]。因此，确定特定区域agr的主要型别较有意义。YANG等[3]发现agr1型是我国儿童人群agr功能缺陷金黄色葡萄球菌的主要型别，而本研究结果显示agr1型也是成年人群agr功能缺陷金黄色葡萄球菌的主要型别（表2）。本研究中，agr2型MRSA所占比例较高，与韩国的数据[11-12]相似。

agr功能缺陷MRSA可分为5个CC，其中CC5（ST5）和CC8（ST239）最为常见。而agr功能缺陷MSSA菌株克隆的多样性更高，有8个CC，以CC1（ST188）为主（表2），这种情况与PÉREZ-MONTARELO等[13]的研究结果一致。CC5是拉丁美洲、德国和西班牙MRSA中最流行的克隆[13]。同样，本研究中CC5与agr功能缺陷的MRSA也显著相关（60.7%）。这些结果表明，临床需要重视探索CC5克隆菌株的发病机制、分子特性及传播影响因素。

agr1常被发现于CC8、CC25、CC22、CC45和CC395菌株中，agr2在CC5、CC12和CC15菌株中较多，而agr3通常由克隆系CC30携带[2]。本研究发现，agr2与CC5显著相关（93.3%），而40%的agr1型菌株属于CC8。

本研究结果显示，60.7%（17/28）的agr功能缺陷MRSA属于ST5-SCCmecⅡ型，25.0%（7/28）属于ST239-SCCmecⅢ型。这一相对较高的同源性在分离自中国儿童和韩国菌血症患者的agr功能缺陷MRSA中也得到证实[3，11]。有研究结果显示，agr功能缺陷MRSA多见于SCCmecⅠ～Ⅲ型[14]，本研究的结果也证实了这一结论。

本研究中，agr功能缺陷菌株共检出20个spa型别，表现出很大的spa遗传多样性。在主要的spa型别中（t002、t037、t189、t311、t2460，≥5株），t002 和t037也被发现于儿童及其他来源的agr功能缺陷菌株[11，14-15]。spa与ST型别间的相关性分析结果显示，t002、t2460和t311菌株属于ST5（CC5）克隆，t037菌株与ST239（CC8）克隆有关，所有t189型菌株均与ST188（CC1）克隆相关。

总之，agr功能缺陷表型在金黄色葡萄球菌临床分离株中的流行率较低，但在MRSA中所占比例高于MSSA。agr功能缺陷MRSA主要为ST5（CC5）-SCCmecⅡ-t002/t311/t2460-agr2（42.9%，12/28）和ST239（CC8）-SCCmecⅢ-t037-agr1（17.9%，5/28），而agr功能缺陷MSSA最常见的型别为ST188（CC1）-t189-agr1（29.4%，5/17）。虽然本研究agr功能缺陷菌株数量不多，但结果依然能反映我国agr功能缺陷金黄色葡萄球菌的流行特征。