林浩,王谦,赵桂秋

(青岛大学附属医院眼科,山东 青岛 266071)

烟曲霉菌是自然界中常见的致病微生物[1]。当人体外部屏障被破坏或免疫功能低下时烟曲霉菌极易致病[2]。烟曲霉菌导致的炎症在充分抗真菌药物治疗后仍难以控制,原因在于其致病机制除了真菌侵袭对正常组织造成破坏之外[3],烟曲霉菌本身具备的抗原性也增加了组织的炎症程度[4-5]。安石榴苷(PUN)是从石榴皮中提取的鞣花酸类物质,因其强大的抗炎作用被广泛应用于中医药及化妆品中[6]。既往研究结果表明,PUN 在抗炎、抗氧化、抗癌、抗真菌、抗细菌等方面均发挥重要作用[7-11]。巨噬细胞是PUN 发挥抗炎作用的靶点[6]。已有研究证实,PUN 能够通过PI3K/Akt/Nrf2/HO-1 通路减少活性氧(ROS)和一氧化氮的产生,增加超氧化物歧化酶1(SOD1)m RNA 的表达,从而抑制脂多糖诱导的巨噬细胞的氧化应激[7]。另有研究表明,PUN 能够通过核因子κB(NF-κB)信号通路抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)基因表达,降低小胶质细胞的炎症反应[12]。本研究旨在探讨PUN 对烟曲霉菌诱导炎症的作用及其可能机制,以期为临床治疗烟曲霉菌感染所致的炎症性疾病提供新思路。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF 级C57BL/6雌鼠(8周龄),由江苏省动物实验中心提供,经检验检疫均合格,全身情况良好。实验动物使用符合美国眼科和视觉研究协会(ARVO)关于动物使用的标准。

1.2 小鼠腹腔巨噬细胞的提取

小鼠腹腔注射体积分数0.03的硫代乙醇培养液1 mL,8 d后于无菌环境下收集腹腔积液细胞。向小鼠腹腔注射10 mL 高糖DMEM(Hyclone,美国),充分按摩后吸出,4 ℃下以12 000 r/min离心10 min,用含体积分数0.10 FBS(Hyclone,美国)的DMEM 重悬细胞,转移至孔板。2 h后光镜下观察到细胞贴壁后更换培养液,进行预处理。

1.3 药物细胞毒性测定

巨噬细胞在96孔板中贴壁后更换含有不同浓度PUN(Sigma,美国)的细胞培养液(体积分数0.10 FBS+DMEM)100μL,分别于24 和48 h 时加入CCK-8(MCE,美国)10μL,37 ℃孵育2 h后,用分光光度计(Eppendorf,德国)测量每孔450 nm 波长处光密度值。

1.4 灭活烟曲霉菌菌丝的制备

烟曲霉菌购自中国普通微生物培养物保藏中心。收集烟曲霉菌的孢子及菌丝,加入体积分数0.75的乙醇,混匀后置4 ℃冰箱过夜灭活菌丝。次日离心菌液,以无菌PBS(Solarbio,中国北京)洗涤3次,离心去上清液,加入DMEM 混匀,细胞计数板计数后调整菌丝终浓度为1×108/CFU。

1.5 实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测各指标mRNA 表达

用12孔板培养巨噬细胞,将细胞分为正常组(normal组,A 组)、加菌对照组(A.F.组,B 组)、加菌加不同浓度PUN 组(A.F.+25 mg/L PUN 组、A.F.+50 mg/L PUN 组、A.F.+100 mg/L PUN组,C、D、E 组)。灭活烟曲霉菌菌丝刺激8 h后,每孔加入500μL RNAisoPlus(大连宝生物工程有限公司),冰上裂解30 min后用细胞刮收集样本至EP管,提取总RNA,按照Prime Script RTreagent Kit With gDNA Eraser(大连宝生物工程有限公司)试剂逆转录步骤,建立2μg 逆转录反应体系。使用β-actin为内参照,应用RT-PCR 仪(Eppendorf公司,德国)进行PCR 扩增反应,分别检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、白细胞介素10(IL-10)、TNF-α、巨噬细胞炎性蛋白2(MIP2)、趋化因子1(CXCL1)m RNA 表达以及诱导型一氧化氮合酶(i NOS)和Toll样受体4(TLR4)m RNA 表达。引物序列于GenBank中查找,由TaKaRa宝生物工程有限公司负责引物的设计及合成。PCR 引物序列见表1。实验重复3次。

表1 PCR 引物序列

1.6 蛋白印迹法(Western blotting)检测IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达

灭活烟曲霉菌菌丝刺激16 h后,于6孔板中每孔加入100μL蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),用细胞刮收集细胞蛋白于1.5 mL EP 管中,置冰上裂解2 h,4℃下以12 000 r/min离心5 min,取上清液,用BCA 蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio,中国北京)测定蛋白浓度并计算上样量。蛋白煮沸变性,行凝胶电泳,转膜,封闭液(Solarbio,中国北京)封闭2 h。加一抗IL-1β(1∶500,美国RD)、IL-6(1∶500,中国Bioss)、TNF-α(1∶400,美国Cell Signaling Technology)、β-actin(1∶1 000,中国武汉Elabscience)、β-tubulin(1∶1 000,中国武汉Elabscience),4 ℃孵育过夜。以PBST 摇洗3 次,每次10 min,加二抗(1∶1 000,中国武汉Elabscience)室温孵育2 h。以PBST 摇洗3次,每次10 min。用ECL(Byotime,中国北京)显色,UVP凝胶成像系统(VILBER LOURM,美国)显像,采用Image J软件分析蛋白条带。实验重复5次。

1.7 DCFH-DA 检测细胞内ROS含量

巨噬细胞在96孔板中贴壁后更换培养液预处理2 h,加入灭活烟曲霉菌菌丝。在相应时间点加入DCFH-DA 探针(1∶1 000,美国MCE)37 ℃孵育20 min,PBS洗涤3次后使用荧光分光光度计,以488 nm 激发波长、525 nm 发射波长,实时检测荧光强度。实验重复3次。

1.8 统计学分析

应用Graph Pad 7.0 软件进行统计分析,计量资料数据以形式表示,组间比较用One-way ANOVA 检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PUN 对小鼠腹腔巨噬细胞的细胞毒性

巨噬细胞贴壁后分别加入含有0、25、50、100、200 mg/L PUN 的细胞培养液培养,在培养24、48 h时,各浓度组光密度值比较差异均无统计学意义(P＞0.05),提示25～200 mg/L PUN 在48 h内对小鼠腹腔巨噬细胞无细胞毒性。见表2。

表2 不同浓度PUN 对腹腔巨噬细胞的细胞毒性(n=6,Dλ/OD,)

表2 不同浓度PUN 对腹腔巨噬细胞的细胞毒性(n=6,Dλ/OD,)

2.2 PUN 对腹腔巨噬细胞炎症因子m RNA 表达的影响

灭活烟曲霉菌菌丝刺激8 h后,B 组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MIP2及CXCL1m RNA 的表达水平较A 组显著升高,PUN 可浓度依赖性降低上述炎症因子m RNA 的表达水平,差异均有统计学意义(F=339.4～2 420.0,P＜0.01)。见表3。

表3 PUN 对相关细胞炎症因子mRNA表达的影响(n=6,)

表3 PUN 对相关细胞炎症因子mRNA表达的影响(n=6,)

2.3 PUN 对巨噬细胞炎症因子蛋白表达的影响

灭活烟曲霉菌菌丝刺激16 h后,B组细胞炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表达水平较A 组显著升高,PUN 可浓度依赖性降低上述炎症因子蛋白表达水平,差异均有统计学意义(F=71.7～501.3,P＜0.01)。见表4。

表4 PUN 对细胞炎症因子蛋白表达的影响(n=6,)

表4 PUN 对细胞炎症因子蛋白表达的影响(n=6,)

2.4 PUN 对巨噬细胞氧化应激水平的影响

巨噬细胞于96孔板中贴壁后,使用PUN 预处理,加入灭活烟曲霉菌菌丝刺激,分别于加菌后1、2、4、8、16、24 h 应用DCFH-DA 探针检测细胞内ROS水平。与加菌刺激前相比较,加菌后细胞内ROS水平升高,于8 h时达峰,随后降低。不同浓度PUN 组间比较,各时间点的细胞ROS水平差异均有统计学意义(F=439.5～739.8,P＜0.01)。见图1。灭活烟曲霉菌菌丝刺激8 h后,RT-PCR 检测结果显示,随PUN 浓度升高,i NOSm RNA 表达水平呈浓度依赖性降低,各组间差异均具有统计学意义(F=683.1,P＜0.01)。见表5。

图1 PUN对巨噬细胞ROS水平的影响

2.5 PUN 对TLR4表达的影响

灭活烟曲霉菌菌丝刺激8 h后,B组细胞TLR4m RNA 表达水平较A 组显著升高,PUN 可浓度依赖性降低TLR4m RNA 的表达水平,差异均有统计学意义(F=3 271.2,P＜0.01)。见表5。

表5 PUN 对细胞iNOS 及TLR4 mRNA 表达的影响(n=6,)

表5 PUN 对细胞iNOS 及TLR4 mRNA 表达的影响(n=6,)

3 讨 论

PUN 提取自石榴皮,是一种水溶性鞣花酸类物质,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等多种作用。特别是其抗炎药理作用,已在人体外肠道模型、猪离体皮肤等多种组织中被证实[13-15]。已有研究表明,巨噬细胞是PUN 在炎症中作用的靶点,其在真菌性炎症疾病的病程中发挥重要作用[16]。巨噬细胞能够识别和内化来自组织微环境的凋亡细胞和外来病原体,并且启动炎症和其他免疫细胞的活化[17],巨噬细胞产生的炎症因子介导的直接损伤和免疫细胞的趋化募集是组织发生过度炎症反应的重要原因。有研究显示,PUN 可以下调脂多糖刺激后RAW264.7细胞系炎症因子的表达[18-20],但PUN 对真菌刺激后巨噬细胞炎症反应的影响尚未见研究报道。本实验对此进行了探讨。

本文RT-PCR 及Western blotting检测结果显示,经PUN 预处理及真菌刺激后,随PUN 浓度升高,巨噬细胞IL-1β等炎症因子以及模式识别受体TLR4的表达水平呈浓度依赖性降低。且ROS检测结果表明,高浓度的PUN 可以抑制灭活烟曲霉菌菌丝刺激后小鼠腹腔巨噬细胞的ROS水平。

大量研究结果表明,NF-κB 是真菌性角膜炎炎症反应中重要的调节因子,它可以调节IL-1β等炎症因子,通过这些细胞因子趋化炎症细胞向病变部位浸润[21]。KIM 等[22]的研究表明,PUN 可直接与神经组织炎症中的NF-κB亚基p50结合,下调其活性,进而影响NF-κB下游炎症因子的产生。炎症因子能够直接导致组织损伤,扩大下游炎症反应,并募集其他炎症细胞,加重真菌性角膜炎的严重程度。XU 等[7]的研究证实,PUN 可以上调Nrf2 介导的通路并增强血加氧酶-1 表达,导致ROS 产生减少和一氧化氮产生过量。此外,PUN 也能够降低人表皮角质形成细胞、泡沫细胞、NIH3T3细胞等的氧化应激水平[23-25]。本实验结果与以往研究结果一致,提示PUN 可对巨噬细胞中炎症因子和ROS的表达产生影响。

综上所述,PUN 能够减轻烟曲霉菌诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的炎症反应,降低巨噬细胞氧化应激水平,并且PUN 预处理能够降低细胞模式识别受体的表达,提示PUN 可能通过下调TLR4表达对巨噬细胞产生抗炎作用。但PUN 抗炎作用的具体机制还有待于进一步研究。