杨祥，徐长征，陈金华，孟胜利，王泽鋆，申硕，陈晓琦

1.武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室，湖北武汉430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北武汉430207

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一种由多种人肠道病毒（human enteroviruses，HEVs）引起的急性传染疾病，多发于5岁以下儿童。临床症状表现为手、足、口、臀等部位出疹及发热等多种临床症状。2008年5月2日，HFMD被纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的丙类传染病进行管理。在中国，2012年前引起HFMD的主要病原为肠道病毒71型（enterovirus A71，EV-A71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16，CV-A16）［1-4］。近年来，柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6，CV-A6）、柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10，CV-A10）等病原导致的HFMD在印度、东亚、日本、欧洲等地持续增加［4-9］，已成为HFMD的主要病原，为HFMD的防控带来更大的挑战。本研究以武汉生物制品研究所有限责任公司生产的EV-A71疫苗Ⅳ期临床研究为基础，分析EV-A71疫苗干预后，HFMD相关肠道病毒病原谱的变化及分子流行病学特征，为HFMD的预防及多价HFMD疫苗的研发和临床研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 标本 采集湖北省潜江市2019年5—12月，谷城县2019年6—12月诊断为HFMD的患儿肛拭子样本，于-80℃保存待检。诊断标准参照《手足口病诊疗指南》（2018年版）。

1.2 主要试剂及仪器 核酸提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；EV-A71型 ／CV-A16型／CV-A10特异性及肠道病毒通用型RNA检测试剂盒购自硕世生物科技股份有限公司；Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit和TaKaRa LA Taq购自宝日医生物工程（北京）有限公司；ABI7500型荧光定量PCR仪和梯度PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 病毒R N A的提取 用核酸提取试剂盒提取样本RNA，-80℃保存待用。

1.4 肠道病毒型别鉴定 提取的RNA用EV-A71型／CV-A16型／CV-A10特异性及肠道病毒通用型RNA检测试剂盒，通过ABI7500型荧光定量PCR仪进行检测。

1.5 肠道病毒V P1区部分基因序列扩增 使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，以肠道病毒阳性样品RNA为模板进行逆转录，根据参考文献［10］合成引物（表1），对VP1区部分基因进行半巢式PCR扩增，反应条件：95℃热启动5 min；95℃变性30 s，42℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸5 min。产物于-20℃保存。

表1 基于VP1区段肠道病毒分型鉴定通用引物Tab.1 Primers used for typing and characterization of VP1 region of enterovirus

1.6 序列分析 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果与GenBank数据库中序列进行比对，确定病原的型别。再用DNAStar 7.0软件对参考株和流行株进行核苷酸序列同源性分析，根据参考文献［11-19］，选取国内外CV-A6、CV-A10、CV-A16、CV-A5各基因型和基因亚型的代表参考株与2019年谷城县和潜江市两地的代表流行株，使用MEGA 6.0软件通过邻接法（neighbor-joining，NJ），p-distance模型构建进化树。通过1 000 Bootstrap评估建树的可靠性，节点上显示70%以上的Bootstrap值。

1.7统计学分析 应用统计学软件SPSS 23.0，采用卡方检验对标本的阳性检出率进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HF MD相关肠道病毒病原谱 共采集HFMD标本520份（谷城县259份，潜江市261份），其中检出肠道病毒阳性样本490份，检出阳性率为94.23%。谷城县男性患儿阳性率为93.80%（121／129），女性患儿阳性率为93.08%（121／130），两者差异无统计学意义（χ2=0.007，P＞0.05）；潜江市男性患儿阳性率为97.45%（153／157），女性患儿阳性率为91.35%（95／104），两者差异无统计学意义（χ2=0.647，P＞0.05）。在实验室检测结果为肠道病毒阳性样品中，共定型487份。其中谷城县检出肠道病毒阳性样本242份，共检出6种肠道病毒，构成比分别为CV-A6 84.30%（204／242）、A16 2.48%（6／242）、A10 7.44%（18／242）、A5 3.31%（8／242）、A4 0.83%（2／242）、A8 0.41%（1／242）、其他未定型的肠道病毒（other enterovirus，Other HEV）1.24%（3／242）；潜江市检出肠道病毒阳性样本248份（含2份CV-A6、A10共感染），共检出4种肠道病毒，构成比分别为CV-A6 54.80%（137／250）、A16 40.4%（101／250）、A5 4.40%（11／250）、A8 0.40%（1／250）。见图1。

图1 谷城县2019年6—12月（A）、潜江市2019年5—12月（B）肠道病毒阳性样本各病原构成比Fig.1 Constituent ratios of pathogens in enteroviruses positive samples in Gucheng County from June to December 2019（A）and in Qianjiang City from May to December 2019（B）

2.2 时间和年龄分布 谷城县和潜江市两地区2019年下半年HFMD的流行各有特点，在流行时间上：谷城县HFMD病例各月分布较分散，9—11月出现1个高峰，而潜江市HFMD病例在时间分布上较为集中，集中在5—8月，见图2。在年龄分布上：谷城县和潜江市两地区主要发病人群为5岁以下儿童，占比分别达100%和98.08%，其中以1~2岁年龄组占比最高，分别为68.73%和3.68%，见图3。

图2 谷城县2019年6—12月（A）和潜江市2019年5—12月（B）HFMD病例月分布Fig.2 Monthly distribution of cases of HFMD in Gucheng County from June to December 2019（A）and in Qianjiang City from May to December 2019（B）

图3 谷城县2019年6—12月和潜江市2019年5—12月HFMD患儿年龄分布Fig.3 Age distribution of children with HFMD in Gucheng County from June to December 2019 and in Qianjiang City from May to December 2019

2.3 分子进化分析 进化树见图4，VP1区核苷酸和氨基酸同源性见表2。结果表明，谷城县、潜江市两地区的CV-A6流行株均属于D3亚型；谷城县的CVA10流行株属于C亚型；谷城县的CV-A16流行株属于B1a亚型，而潜江市的CV-A16流行株属于B1b亚型；两地区的CV-A5流行株与2016年澳大利亚参考株MH111030最为接近。

表2 4种主要病原CV-A6、CV-A10、CV-A16、CV-A5基于部分VP1区同源性分析Tab.2 Homology of partial VP regions of four main pathogens CV-A6，CV-A10，CV-A16 and CV-A5

图4 CV-A6（A）、CV-A10（B）、CV-A16（C）、CV-A5（D）部分VP1区进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on partial VP1 regions of CV-A6（A），CV-A10（B），CV-A16（C）and CV-A5（D）

续图4 CV-A6（A）、CV-A10（B）、CV-A16（C）、CV-A5（D）部分VP1区进化树Fig.4（Continued）Phylogenetic tree based on partial VP1 regions of CV-A6（A），CV-A10（B），CV-A16（C）and CV-A5（D）

3 讨论

自2008年HFMD被列为我国法定丙类传染病以来，截止2018年累计报告HFMD病例2 000多万例，死亡3 670例，其中大部分重症和死亡病例由EV-A71引起［18］，严重威胁着我国婴幼儿的生命健康。2016、2017年，国内3家公司的EV-A71疫苗相继上市，HFMD相关重症和死亡病例明显减少。为了解疫苗干预后HFMD的病原谱特征，本研究以武汉生物制品研究所有限责任公司生产的EV-A71疫苗Ⅳ期临床试验为基础，分析接种地区HFMD肠道病毒病原谱及分子流行病学特征。共收集谷城县2019年6—12月和潜江市2019年5—12月两地区疑似HFMD标本520份，未发现重症和死亡病例，检出肠道病毒阳性样本490份，阳性率94.23%。共检出6种不同型别的肠道病毒，未发现由EV-A71引起的HFMD，表明EV-A71疫苗对接种者产生了很好的保护效果。

在本次HFMD相关病原谱研究中，CV-A6在谷城县、潜江市两地区病原构成比中均占比最高，分别达84.30%和54.80%，超过其他所有病原之和，是引起HFMD的主要病原。而目前已上市的单价EVA71疫苗对其他血清型肠道病毒引起的HFMD无交叉保护作用［20］，因此，加快包含CV-A6组分的多价HFMD疫苗研发，是目前防控HFMD的重要手段。根据参考文献［11，20］，CV-A6在我国的流行可分为3个阶段：第1阶段是2009年以前，病例散发，以D2亚型为主；从2009—2012年为第2阶段，CV-A6开始在广东等地区小规模暴发，此时开始出现D3亚型，该阶段为D2、D3亚型共流行；2013年以后，CV-A6引起的HFMD大规模暴发，此时流行的CV-A6以D3亚型为主。本研究结果显示，谷城县、潜江市两地区的CV-A6均为D3亚型，与我国目前CV-A6的流行现状一致。这可能与D3亚型毒株的毒力和传播能力有关，尽管其分子机制还有待进一步研究，但对今后的疫苗研究及疾病防控具有重要意义。

此外，谷城县、潜江市两地区在HFMD病原构成谱上具有明显差异，CV-A16在潜江市HFMD病原构成中占比第2位，达40.4%，而CV-A16在谷城县HFMD病原构成中占比较低，仅为2.48%。通过进化树的构建和分析显示，两地区流行的CV-A16属于不同亚型，潜江市流行株均属于B1b亚型，谷城县流行株均属于B1a亚型。两地区流行的CV-A16亚型不同，在病原构成谱中占比差异明显，推测两地区CV-A16流行株的传播能力不同，B1b亚型的传播能力强于B1a亚型。

谷城县病原构成中占比第2位的是CV-A10（7.44%），通过进化树的构建和分析显示，谷城县流行的CV-A10为C亚型，与近年来国内CV-A10流行株的亚型一致。而潜江市未发现由CV-A10引起的HFMD，可能是由于潜江市婴幼儿体内存在抗CVA10母传抗体的比例较高［21］。因此，对于由多种病原引起的HFMD的防控，仅依靠单价疫苗很难大幅度降低其发病率，研发多价HFMD疫苗是预防HFMD最有效的手段。另外需要关注的是，CV-A5在两地区的病原构成中均占据第3位，分别为谷城县3.31%、潜江市4.40%，有进一步成为优势病原体的趋势，而目前关于该病毒的相关研究较少，因此需增加对CVA5的相关研究，以便更准确地预防与诊断由CV-A5引起的疾病。

综上所述，2019年EV-A71疫苗在湖北潜江市和谷城县两地区接种后，均未发现由EV-A71引起的HFMD，表明EV-A71疫苗对接种者产生了良好的保护效果。EV-A71疫苗接种后，两地区病原构成均以CV-A6为主，其他病原中CV-A10和CV-A5分别占据一定比例，潜江市CV-A16占比较高。通过对EV-A71疫苗干预后HFMD相关肠道病毒病原谱研究及主要病原VP1序列的分子进化分析，为HFMD的预防及多价HFMD疫苗的研发提供了数据支持。