常彦斌，游灵玲，张晓兵

重庆医科大学附属第一医院检验科,重庆 400016

铜绿假单胞菌(PA)是医院内感染和呼吸机相关性肺炎最常见的细菌[1-5]。PAⅢ型分泌系统(T3SS)的发现是细菌致病机制研究的突出进展，其T3SS主要分泌4种毒力蛋白，即胞外酶(Exo)S、ExoT、ExoY、ExoU，细菌通过Ⅲ型分泌系统的导管装置把T3SS毒力因子注入细胞，诱导细胞坏死、凋亡[6-10]。

据报道，群体感应(QS)系统抑制剂能减弱PA的毒力[11]，阿奇霉素能够影响PA的QS系统信号分子[12-13]。本研究中，选择对PA毒力机制更为关键的毒力基因exoS和exoU作为研究对象[14-15]，通过PCR分析细菌T3SS毒力基因exoS和exoU的分布。用K-B纸片法研究细菌耐药情况，选取exoS、exoU阳性株通过RT-PCR方法研究阿奇霉素对铜绿假单胞菌exoS、exoU mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1菌株来源 从本实验室自2010-2019年保存的临床菌株库中随机选择50株PA，其中38株来自痰液，6株来自尿液，5株来自分泌物，1株来自血液。使用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统鉴定所有菌株到种。

1.2抗菌药物药敏试验 通过K-B法测定PA对10种抗菌药物的耐药率。药敏纸片：头孢他啶、头孢吡肟、左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、庆大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南均为英国Oxoid公司产品。MH培养基由重庆庞通医疗器械有限公司提供。

1.3exoS、exoU基因检测 以煮沸法制备细菌总DNA。用PCR方法检测exoS、exoU基因。依据exoS(GenBank no.AE004091)和exoU(GenBank no.AAC16023)的完整基因序列，采用Primer 3 Plus在线软件设计引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列见表1。各靶基因PCR扩增体系：10 μmol/L上、下游引物各1.25 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5×PCR反应缓冲液5 μL，DNA聚合酶 0.25 μL，总反应体积25 μL(其中模板5 μL)，其余用双蒸水补足至25 μL。……