王少鑫，崔立红，李晓伟，刘新尧，罗 哲，闫志辉

(解放军总医院第六医学中心 消化内科， 北京 100048)

UBE2W[ubiquitin-conjugating enzyme (E2)W]是一种新型泛素结合酶(E2)，催化泛素化过程，在人和鼠组织中均有表达[1-2]。在前期研究中发现UBE2W参与了核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)转录活性的调控[3]，而NF-κB通路作为一种重要的信号传导枢纽，在炎性反应、免疫反应和细胞增殖、凋亡在内的多种生物学效应中均发挥作用，是细胞内的关键信号通路之一[4-6]。由此推测UBE2W可能通过调控NF-κB通路在炎性反应进展中发挥重要作用。本研究中采用小鼠溃疡性结肠炎模型模拟炎性反应过程，探讨UBE2W在葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及动物：小鼠成纤维细胞系L929(军事医学科学院国家生物医学分析中心)。C57BL/6雄性小鼠，约6周，共10只，体质量约20 g(北京唯尚立德生物公司，SPF级，无菌环境中饲养)。

1.1.2 试剂：转染试剂Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司)；小鼠体内转染试剂(英格恩生物有限公司)；葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS, MW:36～50 ku)(MP生物医药公司);UBE2W siRNA 1#-3#(广州锐博生物公司合成)，靶序列分别为siRNA 1#：5′-GTGGATCGTAGACATGGAA-3′, siRNA 2#：5′-GTAGTCGATACCCTTTTGA-3′，siRNA 3#：5′-CGACTACAAAAAGAACTGT-3′。 UBE2W抗体(Thermo Fisher Scientific公司)；GAPDH抗体(锐尔康生物科技公司)；PCR检测试剂盒(TaKaRa公司)；Q-PCR引物(Invitrogen公司合成)。具体序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 Western blot检测UBE2W蛋白：小鼠成纤维细胞L929于DMEM培养基中培养，种植于12孔培养皿中，采用转染试剂Lipofectamine RNA iMAX共转，染2次sicontrol/siUbe2w(50 nmol/L)48 h后收集细胞。然后， 将裂解缓冲液加入混匀后， 沸水浴变性10 min；冷却至室温后进行Western blot，主要包括电泳、转印、孵育抗体及显影过程。 一抗为抗UBE2W兔多抗(1∶500)，肌动蛋白鼠单抗(1∶1 000)为内参。

结肠组织行Western blot检测：将液氮冻存的结肠组织放置预冷的研钵中研磨, 待组织成粉末状后，加入等量2×蛋白质缓冲液，沸水浴变性再冷却后按上述方法行Western blot。……