周哲雯,朱伊敏,王烨菠,王 萍,林函冰,李希宁

(湖州师范学院 医学院，浙江 湖州 313000)

骨质疏松症是一种典型的与老年相关的疾病，其核心发病机制是成骨细胞和破骨细胞的数量与活性失衡导致骨重建受损[1].成骨细胞是成骨的功能细胞，其数量增多和功能增强都可以促进骨形成.研究发现，成骨细胞功能障碍是骨质疏松的主要原因[2-3].目前预防和治疗骨质疏松症的药物主要集中于促进成骨细胞的增殖和分化.

哺乳动物雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一个高度保守的激酶，属于PI3K家族的一员，与细胞的生长、增殖、分化等密切相关[4].雷帕霉素对mTOR的抑制作用在体外可损伤小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)的增殖和成骨分化，并可导致小梁状骨的丢失[5].雷帕霉素抑制mTOR明显阻止了Wnt7b诱导的小鼠ST2细胞分化，相反激活mTOR可以促进BMSCs向成骨细胞方向分化[6]，但mTOR作用于成骨细胞的机制仍有待阐明.本研究分别利用mTOR抑制剂和激活剂改变mTOR磷酸化水平，探讨mTOR磷酸化对成骨细胞的影响，为骨质疏松的防治策略提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-MEM培养基、胎牛血清、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胰蛋白酶(美国Thermo Fisher Scientific公司)；CCK-8试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、青链霉素双抗混合液(北京索莱宝科技有限公司)；mTOR、p-mTOR、ALP、Runx2、osterix抗体与引物(美国Abcam公司).

1.2 方法

(1) 细胞培养：MC3T3-E1细胞株购于中国科学院细胞库.将MC3T3-E1细胞培养于α-MEM完全培养液中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养；每2～3 d更换一次培养液，当细胞密度铺满培养皿80%以上时，用胰蛋白酶消化传代培养至对数期.