徐少林 1，董茜 ，刘燕玲 ，李文辉 ，傅锦坚 1，叶小华

（1.柳州市妇幼保健院检验科/预防保健科，广西柳州 545001；2.广东药科大学公共卫生学院，广东广州 510310）

金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是引起新生儿细菌性感染的主要病原菌之一[1]。而随着抗菌药物的广泛使用，导致具有高致病性和多重耐药性的耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistantS.aureus,MRSA）感染的增加，使治疗效果下降，治疗难度进一步加大[2]。值得重视的是，新生儿免疫系统发育尚不完善，其机体处于易感状态，极易受到病原菌（特别是高致病性、高耐药性的金葡菌和MRSA）侵袭，从而导致皮肤软组织感染、肺炎，甚至引起败血症、心内膜炎等严重感染疾病。同时，新生儿处于生长发育的重要时期，其抗生素的临床用药非常有限。因此，加强新生儿金葡菌感染菌株的耐药性及致病力监测，及时掌握其耐药谱，对临床合理使用抗菌药物和控制流行传播至关重要。目前国内外研究主要局限于研究新生儿MRSA感染菌株[3-5]，但是对MRSA菌株的特异性的耐药和分子特征至今仍未阐明，且缺乏同样具有高致病性的甲氧西林敏感金葡菌（methicillin-susceptibleS.aureus,MSSA）的新生儿感染研究。因此，本研究对新生儿感染MRSA和MSSA菌株的耐药性和分子特征进行深入研究，探究MRSA相关的特异性耐药和分子特征，为指导临床预防和治疗新生儿金葡菌感染提供重要的理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象为2014年4月至2017年5月在柳州市妇幼保健院就诊的社区获得性金葡菌感染的新生儿（年龄≤28 d）。根据发病时间将新生儿感染分为早发型(日龄1～7 d)和晚发型(日龄8～28 d)。收集患者的基本信息，包括性别、年龄、临床症状、感染类型、抗生素使用情况等。本研究中所有患者监护人均签署知情同意，且获得柳州市妇幼保健院伦理委员会批准（NO:2018-085）。

1.2 菌株分离鉴定

菌株分离鉴定实验包括：甘露醇氯化钠培养基显色反应、革兰染色、触媒试验、溶血试验及凝固酶试验，以上实验均为阳性者初步鉴定为金葡菌。采用PCR实验确认金葡菌是否携带16Sr RNA、nuc、mecA基因[6]，均携带16Sr RNA和nuc基因的确认为金葡菌；mecA阳性或头孢西丁耐药的金葡菌被鉴定为MRSA。

1.3 药敏试验

参考美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2015版，对所有金葡菌进行抗生素敏感性试验，包括β-内酰胺类（青霉素、头孢西丁）、大环内酯类（红霉素）、林可酰胺类（克林霉素）、四环素类（四环素）、叶酸代谢抑制剂（复方新诺明）、利福霉素类（利福平）、苯甲醇类（氯霉素）、氟喹诺酮类（环丙沙星）、氨基糖苷类（庆大霉素）、糖肽类（万古霉素）和恶唑烷酮类（利奈唑胺）。多重耐药（multidrug-resistant，MDR）是指对3类或3类以上的抗菌药物不敏感。以金葡菌ATCC 29213作为对照菌株。

1.4 基因检测

利用PCR实验检测细菌DNA中毒素基因，包括免疫侵入基因（scn、chp、sak）、肠毒素基因（sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser、seu）、溶血毒素基因（hla、hlb、hld）、中毒性休克综合征毒素基因（tsst1）及杀白细胞毒素基因（pvl）[7-9]。

1.5 统计方法

采用STATA version 14.0，运用χ2或Fisher确切概率法来确定MRSA和MSSA之间临床特点、耐药表型和分子特征的差异。同时，利用R i386 3.5.1 软件，采用随机森林法对特征变量（耐药表型和分子特征）进行重要性评分，通过计算平均不纯度减少值（mean decrease gini，MDG），评定特征变量的重要性，从而得到MRSA相关的重要特征变量。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 基本情况

共检出92株新生儿金葡菌临床感染菌株，其中29株（31.5%）MRSA，63株（68.5%）MSSA。标本主要来源于痰液（59株，64.1%），其次是来自脓液（22株，23.9%）、血液（5株，5.4%）、其他来源（6株，6.5%）。人群主要以晚发型感染（84.8%）为主，男性52例(56.5%)。

2.2 新生儿金葡菌多重耐药情况

92株新生儿金葡菌中有33株（35.9%）为多重耐药金葡菌（MDRSA），其中9株MDRSA均对红霉素、克林霉素及头孢西丁耐药，提示新生儿金葡菌的主要耐药模式为红霉素-克林霉素-头孢西丁，具体见图1。

图1 新生儿金葡菌的抗生素耐药谱Figure 1 Antibiotic resistance spectrum of S.aureus from neonates

2.3 比较MRSA和MSSA的临床特点

结合相关临床资料，晚期新生儿易发生金葡菌感染而就医，感染金葡菌的新生儿多数引发肺炎（61.4%），少数发生败血症（5.4%）；大多数（59.8%）住院时间≤10 d，少数（8.7%）转入ICU治疗，且有少数新生儿（13.0%）入院前使用过抗生素。不同年龄组新生儿的MRSA比例不同，其中8～14 d新生儿的MRSA比例最高（52.0%），≤7 d新生儿的MRSA比例最低（14.3%），差别具有统计学意义（P<0.05）；感染MRSA的新生儿比感染MSSA的住院时间长，差别具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 新生儿MRSA和MSSA的临床特点比较Table1 Comparison of clinical characteristicsbetween MRSA and MSSA from neonates[n(%)]

2.4 MRSA与MSSA的耐药情况比较

新生儿金葡感染菌株对青霉素（96.7%）的耐药性最高；所有菌株对万古霉素均敏感，大部分菌株对氯霉素和利奈唑胺敏感。新生儿MRSA菌株对青霉素和头孢西丁耐药率均高于90%。此外，MRSA对头孢西丁、红霉素、克林霉素及四环素耐药率均明显高于MSSA，差别均具有统计学意义（P<0.05）。MRSA的多重耐药率明显高于MSSA（79.3%vs 15.9%），差别具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 新生儿MRSA和MSSA的耐药情况比较Table 2 Comparison of resistance between MRSA and MS‐SA from neonates[n(%)]

2.5 MRSA与MSSA的毒素基因携带情况比较

新生儿金葡菌携带的免疫侵入相关基因以sak（95.7%）为主；肠毒素基因携带率均低于25%；携带溶血毒素基因hla（97.8%）和hld（94.6%）的比例较高；菌株携带pvl（17.4%）和tsst1（26.1%）基因比例较高。MRSA与MSSA菌株对各类毒素基因携带率的比较发现，MRSA菌株的sek携带率明显高于MS‐SA菌株（34.5%vs9.5%），且差别有统计学意义（P<0.05）；MRSA菌株pvl携带率稍高于MSSA菌株（24.1%vs14.3%），但差别不具有统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 新生儿MRSA和MSSA的毒素基因携带情况Table 3 Comparison of virulence carriage between MRSA and MSSA from neonates[n(%)]

2.6 筛选MRSA重要特征变量的随机森林分析

采用随机森林筛选MRSA相关的耐药和分子特征，并对特征变量进行重要性排序，分析结果表明，MRSA相关的前5位重要特征变量分别为红霉素耐药、克林霉素耐药、四环素耐药、携带sek基因、携带pvl基因，重要性评分见图2。

图2 MRSA菌株的耐药和分子特征的重要性排序Figure 2 Importance ranking of drug resistance and molecular characteristics of MRSA strains

3 讨论

新生儿易受到金葡菌侵入而发生感染，在治疗新生儿金葡菌感染有限可选的抗生素中，应谨慎用药，避免细菌耐药进一步发展。本课题组对新生儿感染的金葡菌的耐药性和分子特征进行研究，共分离出92株新生儿金葡菌感染菌株，主要以晚发性为主，与既往研究一致，表明金葡菌主要引起新生儿晚发型感染[10]。92株新生儿感染金葡菌中，31.5%为MRSA，与无锡市儿童医院新生儿感染金葡菌中MRSA比例相近（28.6%）[11]，但明显低于既往研究中北京儿童医院新生儿感染金葡菌中MRSA比例（64.5%）[10]。本研究显示，感染MRSA的新生儿比感染MSSA的住院时间长，提示MRSA菌株具有多重耐药性和高致病力的特点；8～14 d新生儿的MRSA比例最高（52.0%），提示2周内新生儿是MRSA感染的重点人群。

近年来金葡菌的耐药水平越来越高，多重耐药情况也越来越严重。既往文献可知，一般人群金葡菌感染菌株耐药情况较新生儿严重，故针对新生儿抗生素的使用应有别于一般人群[12-14]。本研究揭示，近一半新生儿金葡菌对红霉素、克林霉素耐药，仅小部分新生儿金葡菌对头孢西丁和四环素耐药。提示针对新生儿金葡菌感染而言，可将耐药率较低的头孢西丁和四环素作为经验用药，而耐药性相对较高的红霉素和克林霉素则需参考药敏结果使用。同时新生儿金葡菌对复方新诺明、庆大霉素、利福平、环丙沙星、氯霉素及利奈唑胺均保持较高的敏感性，且所有菌株均对万古霉素敏感。以上结果提示新生儿发生金葡菌严重感染时，氯霉素、利奈唑胺等药物能达到较好的治疗效果，万古霉素可作为治疗难治感染的最后一道防线。值得关注的是，本研究单因素分析提示，MRSA对头孢西丁、红霉素、克林霉素及四环素的耐药率均明显高于MSSA，且MRSA的多重耐药率明显高于MSSA；与既往研究结果相似[13,15]，提示MRSA的耐药情况整体比MS‐SA严重，因此给新生儿MRSA感染的临床治疗带来极大挑战。由此可见，临床应控制抗菌药物滥用情况，避免MRSA耐药进一步发展，应根据新生儿感染菌株的耐药谱进行合理用药治疗。

MRSA菌株具有强致病性，毒素基因在菌株致病能力上发挥重要作用。值得关注的是，MRSA菌株致病相关的特异性毒素基因至今仍未阐明。最新研究表明，婴幼儿腹泻与金葡菌肠毒素有关[16]。本研究中新生儿金葡菌中各肠毒素基因携带率均低于25.0%，比其他年龄组金葡菌的肠毒素基因少[17]。但仍需注意的是，母乳中常有金葡菌，是新生儿金葡菌感染最重要的病原体之一，故有必要采取良好的卫生习惯，以减少新生儿感染的风险[18]。本研究中tsst1的携带率为26.1%，明显高于新生儿鼻定殖菌株（0.0%）[19]，提示tsst1可能与金葡菌感染、致病密切相关。本研究单因素分析提示，MRSA菌株中肠毒素sek基因携带率明显高于MSSA菌株，其他毒素基因携带率差别没有统计学意义，与既往研究结果基本一致[19]。既往研究发现，MRSA菌株pvl基因的携带率明显高于MSSA菌株[19-20]；本研究中MRSA菌株pvl基因的携带率稍高于MSSA菌株，但差异无统计学意义，今后可增加样本含量进一步研究确认以上研究结果。同时，MRSA和MS‐SA菌株中大部分的毒素基因携带率均无差别，提示MSSA菌株也具有广泛的毒素基因，其毒力和致病性不容忽视，因此也应引起重视。

随机森林法分析结果表明，红霉素耐药、克林霉素耐药、四环素耐药是MRSA相关的重要耐药特征变量，也揭示了MRSA多重耐药状态可能与对这几类抗生素耐药密切相关；携带pvl基因和sek基因是MRSA相关的重要分子特征变量。

本研究采用单因素χ2分析和随机森林相结合分析方法，深入比较MRSA和MSSA菌株的耐药特征和分子特征，揭示MRSA相关的重要耐药特征变量和分子特征变量，为今后深入探究MRSA相关的耐药机制和致病能力提供重要理论基础。