刘姣 元琳 郝军 张道强

1威海市自体免疫重点实验室青岛大学附属威海市中心医院检验科，山东 264400；2威海市自体免疫重点实验室青岛大学附属威海市中心医院中心实验室，山东 264400

血流感染是临床上严重危及患者生命的感染性疾病，其病死率在25.0%～80.0%［1］。血培养是诊断血流感染的金标准，准确快速鉴定血液中的病原菌尤其是少见菌为血流感染诊断以及早期使用适当的抗菌药物治疗提供了重要依据。目前多数医院使用全自动血培养系统，对于仪器报警后的血培养阳性标本，很多基层医院没有质谱仪，只能靠血培养仪报警后的生长曲线、涂片、染色、镜检、转出培养（阳性瓶菌液转种到平板上分离出单个菌落），进一步鉴定药敏。有一些少见菌涂片染色不典型、转出培养时需要接种特殊培养基（巧克力平板等），缺乏经验的检验人员很容易将一些少见菌漏检，直接影响血培养初步报告的结果准确性，延误临床对血流感染的早期诊断和治疗。现特总结了2例血流感染的少见菌的鉴定经验，结合临床诊疗，报道如下。

1 临床资料

病例1，患者男性，60岁。主诉：无明显诱因头痛1 d，为间断性钝痛，无放射性疼痛，无恶心、呕吐，无明显头晕，无肢体麻木及活动不灵，无胸痛、咯血，无发热、畏寒、寒战，无心慌、胸闷、咳憋，无腹痛、腹胀、腹泻，无尿频、尿急、尿痛。个人史：吸烟40余年，每日20支左右，未戒烟。无遗传病史，无传染性疾病史。患者既往有高血压病史5～6年，在家自服降压药治疗。体格检查：体温36℃，脉搏90次/min，呼吸18次/min，神志清，精神不振，全身浅表淋巴结未触及肿大，双肺呼吸音清，未闻及干湿性啰音。腹软，平坦，无压痛、反跳痛，肝脾未触及，无移动性浊音，下肢无浮肿。脉搏90次/min，律齐，各瓣膜听诊区未闻及杂音。门诊医师给予血常规、血气分析、血凝常规检查后，2019年12月21日将其以“白细胞增高原因待查”收入血液科。12月22日进一步完善相关检查，送检血培养。给予银杏达莫、天麻素改善微循环缓解症状，美洛西林钠/舒巴坦抗感染等对症治疗。12月23日患者家属诉患者有胡言乱语等精神症状，遂转神经内科。实验室电话报告危急值：血培养双侧双瓶阳性，涂片革兰阳性球菌。继续美洛西林钠/舒巴坦抗感染治疗。12月25日，血培养结果猪链球菌Ⅱ型，立即转入感染科。感染科追问病史，患者多年从事养猪专业，否认近期有病死猪接触史。结合病史及辅助检查，患者目前诊断为：人感染猪链球菌病和败血症高血压。考虑该患者为脑膜脑炎型猪链球菌病，结合药敏结果继续给予美洛西林钠/舒巴坦抗感染治疗。12月31日，患者无头晕头痛，无胡言乱语等精神症状，病情好转。

病例2，患者女性，63岁。右侧乳腺癌术后半年，以意识不清1 d、喘憋10 h于2020年1月4日再次入院。体温39.4℃，脉搏58次/min，呼吸20次/min，血压143/83 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），昏迷状态，消瘦貌，查体不合作，四肢末梢皮肤发绀，双侧瞳孔等大等圆，直径3.5 mm，对光反射均迟钝，颈软，口唇发绀，桶状胸，双肺呼吸音粗，可闻及少量湿性啰音，脉搏58次/min，律齐，未闻及杂音。初步诊断：（1）昏迷原因待查；（2）肺部感染；（3）Ⅱ型呼吸衰竭。诊疗ICU护理常规，予以哌拉西林/他唑巴坦抗感染、营养支持及其他对症治疗。送检血培养，完善其他辅助检查。1月6日10：40，实验室电话报告危急值：双侧需氧瓶阳性，涂片革兰阴性小杆菌。患者因脓毒性休克、Ⅱ型呼吸衰竭于12：04抢救无效死亡。1月7日血培养结果为流感嗜血杆菌，药敏结果哌拉西林/他唑巴坦耐药。

2 实验室检查

2.1 阳性报警时间 采用法国梅里埃公司BACT/ALERT 3D 240全自动血培养仪及配套培养瓶。病例1双侧双瓶阳性报警，报警时间为16 h，病例2双侧需氧瓶阳性报警，报警时间约24 h。

2.2 生长曲线特点 病例1约80°角几乎垂直升高（图1）。病例2约20°角缓慢升高（图2）。

2.3 直接涂片革兰染色镜检 从阳性瓶内抽取培养物直接涂片革兰染色油镜观察。病例1猪链球菌：单个或成对细小卵圆形革兰阳性球菌（图3）。病例2流感嗜血杆菌：革兰阴性短小杆菌，细小成堆，两端钝圆，大小为0.4µm×1.5µm（图4）。缺乏经验的检验人员易将细菌与染色液沉渣、细胞碎片等相混淆，不易辨别，易漏掉。流感嗜血杆菌需要与布鲁氏菌鉴别：布鲁氏菌为细小沙滩样革兰阴性杆菌。另外，注意革兰染色完成后，需要再用沙黄溶液复染1次，否则阴性小杆菌譬如流感嗜血杆菌、布鲁氏杆菌很容易因染色不清漏检。

2.4 培养生长特点 立即将培养物转种血平板、巧克力平板及中国蓝平板，置于5%的二氧化碳（CO2）培养箱内35℃培养。病例1血平板培养24 h，菌落细小、圆形、凸起，呈不明显α溶血的灰白色菌落。培养48 h菌落细小，可见菌落周围较明显的α溶血（图5）。病例2培养24 h，血平板、中国蓝平板无菌生长，巧克力平板可见微小、无色透明似露滴样菌落（图6）。流感嗜血杆菌生长需要X、V因子，培养时转种巧克力平板很重要。

2.5 细菌鉴定 法国梅里埃公司全自动细菌鉴定仪VITEK2-Compact。病例1采用GP卡，细菌鉴定最终结果为猪链球菌Ⅱ型；病例2采用NH卡，细菌鉴定最终结果为流感嗜血杆菌，卫星现象阳性。

2.6 细菌药敏试验 采用纸片扩散法（K-B法），药敏判定标准参照CLSI2019版解释标准进行判读［2］。病例1猪链球菌的药敏试验使用5%绵羊血水解酪蛋白琼脂培养基，5%的CO224 h，结果显示对青霉素、头孢曲松、红霉素、头孢吡肟、左氧氟沙星、克林霉素、万古霉素敏感。病例2流感嗜血杆菌的药敏试验使用HTM培养基，5%CO218 h，结果显示β-内酰胺酶阳性，对氨曲南、亚胺培南、左氧氟沙星和美罗培南敏感，阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、氨苄西林、头孢呋辛、哌拉西林/他唑巴坦耐药，头孢噻肟、头孢吡肟非敏感。用Nitrocefin纸片法测定其β-内酰胺酶。

2.7 血清学分型 山东省疾病控制中心对病例1上送的菌株进行血清学分型，PCR基因分型均为猪链球菌Ⅱ型阳性。

图1 病例1生长曲线特点

图2 病例2生长曲线特点

图3 猪链球菌镜下形态（革兰染色×1000）

图4 流感嗜血杆菌镜下形态（革兰染色 ×1000）

图5 猪链球菌在血平板上48 h菌落形态

图6 流感嗜血杆菌在巧克力平板上24 h菌落形态

3 讨 论

病例1患者临床表现无特异性，诊断困难，辗转3个科室，最初以“白细胞升高原因待查”收入血液科，后因患者胡言乱语等精神症状转入神经内科，最终因血培养结果是猪链球菌得以确诊转入感染科。人感染猪链球菌病是危害严重的人畜共患病，人感染后病死率极高［3］。血培养检出猪链球菌是诊断该病的金标准，血培养结果结合临床症状可大大提高猪链球菌感染诊断的临床价值［4］。血培养瓶在BACT/ALERT血培养仪阳性报警时间16 h，药敏结果对青霉素、左氧氟沙星、万古霉素、红霉素、克林霉素均敏感，与报道一致［5］。猪链球菌病是国家规定的二类动物疫源性疾病［6］，微生物检验人员对猪链球菌革兰染色镜下形态和菌落形态学的早期认知，及时提醒临床正确的诊断和有效的治疗，对于挽救患者的生命、减少后遗症和有效控制疫情十分重要。猪链球菌病的感染途径主要是接触病死猪，但也有否认接触史的报道［7-8］。皮肤损伤、养殖生猪、个人卫生习惯、个人生活习惯（长期吸烟史、长期饮酒史）都构成易感因素。因此临床遇有白细胞增高、有接触病死猪或生猪者和长期吸烟史等情况，要考虑猪链球菌感染的可能。目前对猪链球菌治疗效果较好的药物主要有青霉素、氨苄西林、第3/第4代头孢菌素［9］。

病例2对于血培养阳性瓶直接涂片染色镜检的准确识别和转出培养基的选择都有较高的要求，否则很容易将流感嗜血杆菌误诊漏诊。流感嗜血杆菌涂片染色不易看到原因如下：（1）形态不典型或细菌太小而被忽略；（2）不易被革兰染色，所以需要用沙黄溶液复染1次。流感嗜血杆菌属于苛氧菌，对其分离培养反映着实验室的鉴定水平［10］。有的基层医院血培养阳性瓶只转种血平板和中国蓝平板，易将流感嗜血杆菌漏掉。如果怀疑流感嗜血杆菌，除了转种巧克力平板，也可将报警阳性的血培养瓶中的菌液转种至血平板上后，在一区与二区交叉划线处点种金黄色葡萄球菌，在金黄色葡萄球菌周围有卫星样菌落生长，结合巧克力平板生长特点，可以初步判定为流感嗜血杆菌。流感嗜血杆菌药敏试验需要专用的HTM平板，药敏结果β-内酰胺酶阳性，氨曲南、亚胺培南、左氧氟沙星和美罗培南敏感，哌拉西林/他唑巴坦等多种抗菌药物耐药。在体外药敏结果未报告时经验用药哌拉西林/他唑巴坦抗感染是无效的，患者最终因病情危重死亡。由此可见准确及时的少见菌的鉴定及药敏具有非常重要的临床价值［11］。

血培养中少见菌的正确鉴定对于血流感染的早期诊断和治疗起着至关重要的作用。临床医生从经验性用药到恰当的抗生素治疗依赖于微生物鉴定和药物敏感性试验结果。微生物工作人员应该加强血培养中少见菌的认知，快速准确得出病原学结果，为临床诊断治疗提供依据。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。