向丽萍 范斌强 杨志龙 伍 强 余有贵

(1.邵阳学院食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000；2.生态酿酒技术与应用湖南省重点实验室，湖南 邵阳 422000；3.湖南湘窖酒业有限公司，湖南 邵阳 422000)

固态发酵中真菌种群主要来源于大曲[1]，大曲中的微生物主要来自原料、器具、空气、水等[2]，其微生物种类、数量以及群落结构对大曲品质有直接影响[3]。根据群落结构和功能不同，可以将大曲中的微生物分为霉菌、酵母菌、细菌等[4]。大曲中酵母优势菌群主要为酿酒酵母和东方伊萨酵母[5]，酵母是白酒酿造过程中主要的功能菌[6]；产酯酵母又叫生香酵母，能促进酯类的生成，形成白酒的特征风味物质[7]。朱文优[8]通过比较夏秋两季高温大曲中的真菌群落结构，发现在发酵前期Pichia、Saccharomycopsis和Wickerhamomyces是夏秋两季大曲中的主要真菌；Pichia是秋季大曲整个生产过程中的主要真菌类群，Thermoascus是夏季大曲发酵后期的优势真菌类群。刘建学等[9]从浓香型白酒酒醅中筛选出两株高产酯的戴尔有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)。伍强等[10]从野生猕猴桃中筛选鉴定出一株适于猕猴桃果酒发酵的酿酒酵母，制成的果酒产品具有良好的ACE抑制活性。董琪等[11]从浓香型大曲中分离得到一株可耐受42 ℃高温且具有一定发酵产酒能力的酵母菌，该菌株经鉴定为Zygosaccharomycescidri。阳秀莲等[12]从不同杨梅鲜果及果园环境中筛选得出一株发酵性能好耐受性强的酿酒酵母RY1。刘延波等[13]从中高温大曲中分离得到一株名为Pichiakudriavzevii的酵母菌且具有很好的耐高温耐乙醇性能。应静等[14]用5种不同的商业酵母菌发酵甘蔗酒，确定出两株酵母菌更适宜用于甘蔗酒酿造。

浓香型白酒回糟酸度高，导致酵母菌产酒率低，丢糟残余淀粉含量高，影响企业的经济效益及生态效益。目前，对大曲中酵母菌研究大多集中在分离筛选、鉴定[15-16]等方面，也有对其耐高温、耐乙醇、耐酸等特性进行研究的[17-18]。将耐高温、耐酸性等耐受性较好的酵母菌应用于浓香型白酒生产中，对解决浓香型白酒中回糟酸度高、残余淀粉含量高的现状具有重要意义。研究拟以中高温大曲为研究对象，通过平板划线纯化、WL培养基形态观察及显微镜观察对中高温大曲中酵母菌进行初步鉴定，再通过TTC培养基染色筛选、差异酸度培养基筛选适用于回糟发酵耐酸性产酒精能力强的酵母菌，并进行分子生物学鉴定、生物学特性及回糟发酵小试研究，为进一步提高浓香型白酒回糟发酵出酒率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中高温大曲：4个月成品曲，湖南省湘窖酒业有限公司；

黄水：湖南省湘窖酒业有限公司；

蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、琼脂等培养基配制试剂：分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司；

美兰染液：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；

香柏油：上海生物制品研究所有限责任公司；

TTC：化学纯，博立生物制品有限公司。

1.2 培养基

分离培养基：采用YEPD培养基，115 ℃灭菌20 min；

形态鉴定培养基：采用WL培养基，121 ℃灭菌20 min；

高粱汁培养基：500 g高粱粉与4倍体积蒸馏水充分混合，加入质量分数为5%液化酶搅拌均匀，80 ℃水浴酶解2 h，再加入质量分数为5%的糖化酶搅拌均匀，60 ℃水浴酶解4 h，离心过滤，加水稀释至糖度为10～12 °Bx；

TTC培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂7.5 g，水500 mL，121 ℃灭菌20 min，无菌环境加入0.25 g TTC。

1.3 仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅：G154-DWS型，致微(厦门)仪器有限公司；

便携式pH计：LE438型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

紫外分光光度计：UV-3802型，重庆万达仪器有限公司；

电子式液体密度计：BHOM-SJ04型，石家庄市百亨通用仪器仪表制造有限公司；

电子显微镜：AE2000+MoticamS3型，麦克奥迪实业集团有限公司；

单人单面垂直净化工作台：SW-CJ-1FD型，苏州博莱尔净化设备有限公司；

电热恒温水浴锅：H21-6型，北京市东霞电子仪表厂；

万能粉碎机：FW-400A型，北京中兴伟业仪器有限公司；

恒温培养箱：SCIENTZ-18N型，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 中高温大曲中酵母菌的分离纯化与初筛 无菌条件下称取25.0 g成品曲样品至装有225 mL无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，同时制备10-2，10-3，10-4，10-5，10-6倍的稀释样品匀液，吸取0.1 mL稀释液涂布至YEPD富集培养基中，28 ℃恒温培养48 h。挑选符合酵母形态的单菌落菌株进行平板划线3次，获得纯种菌株。采用TTC培养基筛选，菌株颜色越深其产酒精能力越好，通过观察菌落颜色筛选产酒精能力较强的纯化菌株。将纯化菌株接种于WL培养基中，观察菌落形态，通过显微镜观察确定细胞结构，并对其进行初步分类。将纯化的菌株转移到YEPD斜面培养基上培养，待菌株菌落生成后，置于4 ℃冰箱保藏。

1.4.2 耐酸性酵母菌的复筛 将纯化菌株接种于YEPD液体培养基中，28 ℃恒温培养1 d，调整种子活化液浓度为1.0×107CFU/mL，采用富含有机酸的黄水调节YEPD液体培养基的pH，设置差异酸度梯度为pH 2.5，3.0，3.5，4.0，4.5。以体积分数2%的接种量将活化液接种至差异酸度YEPD培养基中，同时空白对照，28 ℃恒温培养3 d，利用紫外分光光度计测定560 nm下菌液的OD值，OD值越大，酵母菌的生长活性越强，酵母菌的耐酸性越强。

将纯化菌株接种于YEPD液体培养基中，28 ℃恒温培养1 d，调整种子活化液浓度为1.0×107CFU/mL，采用富含有机酸的黄水调节高粱汁培养基的pH，设置差异酸度梯度为pH 2.5，3.0，3.5，4.0，模拟真实白酒发酵酸性环境。以体积分数2%的接种量将活化液接种至差异酸度高粱汁培养基中，28 ℃恒温发酵9 d，蒸馏后检测酒精度，每组进行3次重复。选取酸性环境下产酒精能力较高的酵母菌进行进一步研究。

1.4.3 酵母菌分子生物学鉴定 将筛选得到的酵母菌送至北京六合华大基因有限公司进行基因测序，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增，PCR扩增体系为：Super Mix 15 μL，Primer F(10p)1 μL，Primer R(10p)1 μL，模板(ng/μL)1 μL，ddH2O 12 μL。PCR扩增条件：96 ℃、10 min；96 ℃、20 s，56 ℃、20 s，72 ℃、30 s，35个循环；72 ℃、10 min，对PCR产物进行琼脂糖凝胶检测，纯化后测序。并在NCBI数据库中进行同源序列比对，采用MEGA.7.0软件构建系统发育树。

1.4.4 耐酸性酵母菌的生物学特性研究

(1)耐酸性：配制pH 2.5，3.0，3.5，4.0，4.5的高粱汁培养基，灭菌后待用。无菌条件下，以体积分数2%的接种量将筛得的酵母菌种子液加入盛有100 mL差异酸度高粱汁培养基的锥形瓶中，28 ℃恒温培养2～3 d，测定OD560 nm值，每组平行3次。

(2)耐高温性：无菌条件下，以体积分数2%的接种量分别将筛得酵母菌种子液加入含有100 mL的高粱汁培养基的锥形瓶中，分别置于36，40，44，48，52 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，测定OD560 nm值，每组平行3次。

(3)耐酒精能力：无菌条件下，分别配制100 mL酒精度为2%vol，4%vol，6%vol，8%vol，10%vol的高粱汁培养基，再接种体积分数2%的筛得酵母菌种子液，28 ℃ 恒温培养2～3 d。测定OD560 nm值，每组平行3次。

(4)生长曲线：无菌条件下，以体积分数2%的接种量将筛得酵母菌种子液加入含有250 mL的YEPD液体培养基的锥形瓶中，28 ℃恒温培养，每隔2 h用无菌移液枪吸取1.00 mL培养液，稀释5倍后，利用紫外分光光度计检测OD560 nm值，以不接种的YEPD培养基为对照组，重复3次，绘制并对比分析酵母菌的生长曲线。

1.4.5 耐酸性酵母菌发酵小试研究 扩大培养筛得酵母菌，调整种子活化液中酵母菌浓度处于1×107CFU/mL。参照张海英[19]的方法，以湘窖浓香型白酒回糟为原料，以4.5%的回糟曲添加量、0.2%糖化酶添加量、0.5%酵母菌液添加量进行混合，同时以不添加酵母菌菌液为空白组，以商用安琪酵母菌液为对照组，每组平行3次，分装至玻璃瓶中，封口后置于浓香型白酒泥窖窖池上层醅中，模拟真实回糟发酵环境，冬季发酵1个月。按照DB34/T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》检测糟醅残余淀粉含量、还原糖含量及酒精度。

1.4.6 数据处理 试验数据采用Origin和Word软件进行图表绘制，通过SPSS 软件对数据进行显著性分析，利用MEGA 7.0软件对酵母菌测序序列进行系统发育树的建立。

2 结果与分析

2.1 中高温大曲中酵母菌的分离纯化与初筛

从YEPD富集培养基上挑取25株菌种作进一步分离纯化，分别编号为dq1～dq25，根据酵母菌的生长情况挑选出3株活性较强的酵母菌dq1、dq4和dq9，其中3株酵母菌在TTC培养基、YEPD培养基、WL培养基的菌落形态和细胞结构见图1。菌株dq1在TTC培养基上显色较深于菌株dq4和dq9，其发酵能力较优于其他两株菌。3株菌株菌落皆呈乳白色，表面光滑湿润，细胞呈圆形或椭圆形，符合《真菌手册》中酵母菌的菌落与细胞结构。

从左至右依次为TTC培养基、YEPD培养基、WL培养基、细胞形态，从上至下依次为菌株dq1，dq4和dq9

2.2 中高温大曲中酵母菌的复筛

由图2可知，当pH>2.5时，不同菌种生长活性存在显著性差异(P<0.05)。由于不同酵母菌对酸性条件适应能力不同，酵母菌因生长环境酸度不同其生长活性也不同。当pH为2.5时，不同菌株的生长活性不存在显著性差异(P>0.05)；当pH为3.0时，3株酵母菌的OD560 nm值强于pH为2.5的，由于OD值越大，其生长活性越强，因此当pH为3.0时，3株酵母菌的生长活性强于pH为2.5的。当pH为3.0时，菌株dq1和dq4的生长活性显著高于菌株dq9；当pH为3.5时，菌株dq1的生长活性显著强于其他两株菌，说明菌株dq1的耐酸性最强，因此确定以菌株dq1和dq4进行产酒精能力筛选。

字母不同表示同一pH下不同菌株生长活性差异显著(P<0.05)

对菌株dq1和dq4进行差异酸度高粱汁培养基筛选，其在不同pH下的高粱汁差异酸度培养基中的产酒精能力见图3。由图3可知，在pH 2.5和pH 4.0条件下，两株菌株的产酒精能力无显著性差异(P>0.05)。在pH 3.0时，菌株dq1的产酒精能力显著大于菌株dq4的(P<0.05)；而pH 3.5时，菌株dq4的产酒精能力显著强于菌株dq1的(P<0.05)。

字母不同表示同一pH下不同菌株产酒精能力差异显著(P<0.05)

结合差异酸度YEPD培养基中酵母菌生长活性筛选和差异酸度高粱汁发酵产酒精能力的筛选，确定酵母菌dq1为耐酸性较强、产酒精能力较优的酵母菌，因此将酵母菌dq1进行分子生物学鉴定。

2.3 耐酸性酵母菌的分子生物学鉴定

根据测序结果，菌株dq1扩增产物的碱基长度约为750 bp，将所得序列提交至NCBI数据库进行同源性比对并构建系统发育树，结果见图4。根据同源性对比发现菌株dq1与Saccharomycescerevisiae(MT322849.1)序列相似性达100%；与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)聚于一支，鉴定所筛选的菌株dq1为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。酿酒酵母是白酒发酵中至关重要的微生物，在发酵等行业中具有广阔的应用前景。

图4 系统发育树

2.4 耐酸性酿酒酵母的生物学特性分析

由图5可知，菌株dq1在不同pH、温度、酒精浓度下的生长活性存在显著性差异(P<0.05)。菌株dq1在pH 3.0时的生长活性显著大于pH 2.5时的，故菌株dq1能耐受pH 3.0的酸性，较葛隐等[20]研究中的耐酸性酵母菌的耐酸能力(pH 3.5)强，与李彦芹等[21]从酒醅中分离筛选得到酵母菌耐酸性一致；菌株dq1在48 ℃下的生长活性显著大于52 ℃下的，因此菌株dq1能耐高温48 ℃，优于刘延波等[13]研究中耐高温45 ℃酵母菌；菌株dq1在6%vol酒精度环境中的生长活性显著大于8%vol时的，因此菌株dq1能耐酒精度6%vol，弱于伍强等[22]从野生猕猴桃中筛选出的酿酒酵母的耐酒精度12%vol；菌株dq1在2～8 h时处于对数增长期，适应环境后迅速生长繁殖，14 h后处于稳定期。

图5 酿酒酵母dq1的生物学特性

2.5 耐酸性酿酒酵母的发酵小试分析

以浓香型白酒回糟糟醅为发酵原料，对发酵前后糟醅的淀粉及还原糖质量分数进行检测分析，同时对空白组、试验组及对照组的糟醅进行蒸馏测其酒精度，相关结果如表1所示。

表1 优良酵母菌发酵糟醅的理化指标†

由表1可知，小试发酵后糟醅中的淀粉及还原糖质量分数显著降低(P<0.05)，主要是依靠回糟曲中霉菌的糖化作用和回糟曲中酵母菌及试验组添加的耐酸性酿酒酵母dq1的发酵作用。同时，酿酒酵母dq1试验组的糟醅中淀粉和还原糖质量分数显著低于空白组及安琪酵母对照组的(P<0.05)，而酿酒酵母dq1试验组的糟醅中酒精含量显著高于空白组及安琪酵母对照组的(P<0.05)，其中淀粉质量分数较空白组降低了1.0%，残糖质量分数较空白组降低了1.3%，主要是因为回糟pH在3.0左右，而酿酒酵母dq1能耐酸性为pH 3.0，且在较低pH环境中能一定程度上进行发酵。综上，酵母菌dq1在回糟发酵中能够加强残糖利用率，有效提高糟醅中酒精含量，从而提高回糟出酒率。

3 结论

通过对湖南省湘窖酒业有限公司中高温大曲中酵母菌进行分离筛选及分子生物学鉴定，获得一株优良酵母菌dq1，经鉴定为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；特性研究结果表明，酿酒酵母dq1可耐受pH 3.0、48 ℃，其pH和高温耐受性具有明显优势；回糟发酵小试研究中，酿酒酵母dq1的添加提高了回糟中14.9%的残糖利用率，可作为浓香型白酒回糟发酵的优势酵母菌。研究仅为小试，后续可将优良酵母菌制备强化大曲用于中试试验，进一步探究其对浓香型白酒回糟发酵的影响。