岳彩霞 陈 磊 王文魁 李桂兰 胡永婷

(山西农业大学动物医学学院，山西 太谷 030801)

山楂酸(maslinic acid，MA)属于三萜酸类物质，存在于多种可食用的天然植物中，如山楂、红枣、油橄榄和枇杷叶等[1-3]，具有抗炎、抗氧化和抗2型糖尿病等多种生物学活性[2,4-6]。已有研究[2]表明，山楂酸在体内具有抑制急性炎症的作用，对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀有保护作用。体外研究[3,7]也发现，MA的抗炎机制与抑制白介素6(Interleukin-6，IL-6)、白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)等细胞因子的分泌有关。诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)是NO合成的调控因子，受细胞因子的诱导表达和调节[8-9]。Janus激酶/信号转导与转录激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)是重要的炎症信号转导途径之一，能够介导免疫应答[10]。信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导炎症反应的关键性调控因子[11]。

目前，MA调控炎症的研究主要集中于体外动物模型中抗炎效果的观察及细胞模型中抑制炎症因子的表达[2-3,12]。王乐旬等[7]研究发现MA可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应机制可能与调控NF-κB、STAT3和AKT的活性相关，然而，MA在LPS诱导的RAW264.7细胞中是否通过调控STAT3的磷酸化发挥抗炎作用的具体分子机制尚不明确，研究拟利用课题组[13]前期建立的LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，在体外细胞水平观察MA对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响，进一步探讨MA能否通过调控STAT3的磷酸化来减轻LPS诱导的RAW264.7细胞的炎性反应，为揭示MA的抗炎机制、综合开发利用MA作为天然抗炎药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

RAW264.7细胞：中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.1.2 药品与试剂

MA(CAS：4373-41-5)：纯度≥98%，美国Sigma公司；

脂多糖(LPS)和DCFH-DA：美国Sigma公司；

DMEM培养基：美国gibco公司；

标准胎牛血清：杭州四季青生物技术有限公司；

核蛋白提取试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；

NO测试试剂盒：碧云天生物技术研究所；

IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA试剂盒：上海江莱生物技术有限公司；

β-actin抗体：北京中杉金桥生物公司；

STAT3和iNOS抗体：武汉三鹰技术有限公司；

p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)、JAK2、p-JAK2和SOCS3抗体：北京博奥森生物技术有限公司；

辣根过氧化物标记山羊抗鼠和山羊抗兔IgG：北京康为世纪生物科技技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 RAW264.7细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5.0% CO2的细胞培养箱中。

1.2.2 给药及分组 取对数生长期的RAW264.7细胞，参照课题组[13]前期建立的LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型进行分组，分为对照组(以含10%胎牛血清的完全培养基培养)、LPS模型组(以含1 μg/mL LPS的完全培养基培养24 h)和山楂酸组(不同浓度的山楂酸预处理2 h后，再用含1 μg/mL LPS和相应浓度山楂酸的完全培养基继续培养24 h)，每组至少设3个重复。

1.2.3 NO含量的测定 取对数生长期的细胞接种至96孔板，以不同浓度的LPS单独刺激RAW264.7细胞24 h，并以不同浓度的山楂酸预作用细胞2 h后，再用含1 μg/mL LPS继续培养进行试验，每组设6个重复孔。培养结束后，按照试剂盒说明书进行NO含量的测定。

1.2.4 ELISA检测相关的细胞因子 取对数生长期的RAW264.7细胞，药物作用培养结束后，吸取每组细胞的上清液，加入96孔板，按照ELISA试剂盒的操作说明，分别测定细胞因子IL-6、IL-1β和IL-10的含量，并进行统计分析。

1.2.5 蛋白提取及Western blot试验 按照试验分组培养结束后，用现配的RIPA细胞裂解液裂解细胞30 min，提取各组RAW264.7细胞总蛋白，并按照核蛋白提取试剂盒说明书提取相应的核蛋白。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%的脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗(HRP标记)室温孵育1 h后，暗室内ECL显色法曝光，进行蛋白条带定量分析。

1.2.6 ROS的测定 取对数生长期的RAW264.7细胞接种于12孔板，按试验分组进行细胞爬片，作用结束后，吸出培养基，用PBS清洗，每组加入含10 μmol/L DCFH-DA的无血清培养基，37 ℃避光孵育细胞30 min，弃掉培养基，PBS清洗。取出细胞爬片，在荧光显微镜(200×)下观察荧光强度并拍照。

1.3 数据分析

采用Graphpad Prism 5软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差，所有数值使用mean±SD表示，并设置多个重复，P<0.05、P<0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 MA对RAW264.7细胞NO生成量的影响

由图1(a)可知，与正常对照组相比，NO生成量随LPS刺激浓度的升高显著增加(P<0.01)；由图1(b)可知，与LPS模型组相比，5，10，15，20，25 μmol/L MA干预后NO含量依次显著降低(P<0.01)，且呈一定的剂量依赖性，而30 μmol/L MA作用后NO含量有所增加，可能与MA的剂量较大有关。综上，MA可以明显抑制由LPS引起的RAW264.7细胞的NO生成量增加。

1.空白组 2.LPS组 3.5 μmol/L MA+LPS 4.10 μmol/L MA+LPS 5.15 μmol/L MA+LPS 6.20 μmol/L MA+LPS 7.25 μmol/L MA+LPS 8.30 μmol/L MA+LPS ##.与对照组相比P<0.01 **.与LPS组相比P<0.01

2.2 MA对RAW264.7细胞因子释放和iNOS蛋白表达的影响

由图2(a)～图2(c)可知，LPS刺激RAW264.7细胞后IL-6、IL-1β和IL-10释放显著增加，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，MA可不同程度地拮抗RAW264.7细胞中IL-6和IL-1β的释放，而与LPS模型组相比，MA作用可显著增加RAW264.7细胞中IL-10的含量(P<0.01)，且呈一定的剂量依赖性。研究表明，受LPS刺激的巨噬细胞会产生大量的炎症因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等，导致炎症细胞浸润，与炎症的发生发展密切相关[14]，而IL-10是巨噬细胞产生的一种重要的抗炎细胞因子，其表达对于炎症在进行免疫干预治疗方面十分关键[15]。研究结果显示，MA能明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β、IL-6的释放，增加IL-10的含量，从而可以较好地抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。

iNOS是重要的炎症因子，在LPS的刺激下iNOS表达增加进而诱导NO的大量产生[16]。采用Western blot法检测了LPS诱导后RAW264.7细胞中iNOS的表达，如图2(d)和图2(e)所示，10，15，20 μmol/L MA可剂量依赖性地抑制LPS诱导的iNOS蛋白的表达(P<0.05)，而20 μmol/L MA单独刺激细胞，iNOS蛋白的表达与对照组无显著差异(P>0.05)。NO是iNOS的产物，炎症疾病发生时iNOS通常表达增加，因此抑制iNOS的表达对减轻炎症反应很重要[8-9,16]。在试验中，可以得出MA能通过抑制LPS诱导的iNOS表达，进而抑制NO的释放。

1.空白组 2.LPS组 3.10 μmol/L MA+LPS 4.15 μmol/L MA+LPS 5.20 μmol/L MA+LPS 6.20 μmol/L MA ##.与对照组相比P<0.01 #.与对照组相比P<0.05 **.与LPS组相比P<0.01 *.与LPS组相比P<0.05

2.3 MA浓度对RAW264.7细胞STAT3的影响

STAT3在调控iNOS过程中发挥了重要的作用[17]，利用Western blot检测MA对LPS诱导的RAW264.7细胞STAT3的Y705和S727位点磷酸化产生影响，结果如图3(a)所示，LPS刺激能快速诱导胞内STAT3的酪氨酸和丝氨酸磷酸化，而经不同浓度(5，10，15，20 μmol/L)的MA处理细胞后，胞内p-STAT3(Y705)和p-STAT3(S727)蛋白的表达明显被抑制(P<0.01)，且呈剂量依赖性。已有研究[18]表明，STAT3的磷酸化有助于STAT3的二聚化并促进其核转位并发挥转录活性，由此猜测MA是否也抑制STAT3的入核，通过提取细胞核蛋白进行检测，结果如图3(b)所示，LPS刺激后STAT3快速入核，细胞经MA处理后核内p-STAT3(Y705)和p-STAT3(S727)蛋白表达显著下降(P<0.05)，并且呈剂量依赖性。由此得出，MA能下调LPS诱导的RAW264.7细胞p-STAT3的表达并抑制STAT3的核转位，p-STAT3的表达量与MA浓度具有明显的量效关系。

1.空白组 2.LPS组 3.10 μmol/L MA+LPS 4.15 μmol/L MA+LPS 5.20 μmol/L MA+LPS 6.20 μmol/L MA+LPS ##.与对照组相比P<0.01 **.与LPS组相比P<0.01 *.与LPS组相比P<0.05

2.4 MA刺激时间对RAW264.7细胞STAT3的影响

选用20 μmol/L的MA预孵细胞2 h，1 μg/mL LPS分别作用细胞0，1，2，4，8 h后，检测细胞和核内p-STAT3的蛋白表达变化。如图4所示，LPS刺激4～8 h时，MA能显著降低胞内STAT3的酪氨酸和丝氨酸磷酸化水平(P<0.05)，且呈一定的时间依赖性，在LPS刺激8 h时，MA能显著降低核内p-STAT3(Y705)和p-STAT3(S727)的表达(P<0.01)，由此表明，LPS诱导的RAW264.7胞内p-STAT3的表达与MA浓度之间具有一定的时间依赖性。

1.空白组 2.LPS 1 h 3.LPS 2 h 4.LPS 4 h 5.LPS 8 h 6.空白组 7.20 μmol/L MA+LPS 1 h 8.20 μmol/L MA+LPS 2 h 9.20 μmol/L MA+LPS 4 h 10.20 μmol/L MA+LPS 8 h **.与LPS组相比P<0.01 *.与LPS组相比P<0.05

研究[19]表明，STAT3在增殖、生长、凋亡、免疫等重要的生理过程中发挥调控作用，而STAT3的异常活化可导致炎症反应与多种疾病相关。已有研究[20-21]证实，STAT3作为典型的炎症信号通路可以调节iNOS及相关促炎因子包括IL-1β、IL-6和TNF-α等的表达。由此可以推测，MA可以通过对STAT3磷酸化的影响抑制其合成iNOS及对炎症因子IL-1β和IL-6的释放。

2.5 MA对RAW264.7细胞p-JAK2和SOCS3表达的影响

如图5所示，与对照组相比，LPS模型组JAK2的磷酸化水平显著升高(P<0.05)，SOCS3蛋白表达水平显著降低(P<0.01)；与LPS模型组相比，不同浓度的MA可抑制p-JAK2的蛋白表达(P<0.05)，而激活SOCS3蛋白表达(P<0.05)，并均呈一定的剂量依赖性。结果表明，MA能抑制JAK2的磷酸化水平，激活SOCS3的蛋白表达，与其抗炎机制相关。

1.空白组 2.LPS组 3.5 μmol/L MA+LPS 4.10 μmol/L MA+LPS 5.15 μmol/L MA+LPS 6.20 μmol/L MA+LPS ##.与对照组相比P<0.01 **.与LPS组相比P<0.01 *.与LPS组相比P<0.05

STAT3的激活依赖于JAK的活化，且有研究[22]表明，SOCS蛋白可以抑制JAK的活性。故检测了MA对RAW264.7细胞中p-JAK2和SOCS3表达的影响，进一步确定MA对JAK/STAT通路的作用，试验结果表明，MA可以通过调控JAK2/STAT3通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应。

2.6 MA对RAW264.7细胞ROS水平的影响

细胞内ROS的产生对于炎症信号传导发挥着重要的作用。采用DCFH-DA检测山楂酸对RAW264.7细胞中ROS水平的变化。荧光显微镜(200×)下观察如图6所示，与对照组相比，LPS刺激后荧光强度显著增强(P<0.01)，不同剂量的山楂酸干预后，荧光强度依次减弱，表明ROS水平显著被抑制(P<0.01)，提示山楂酸可能通过降低RAW264.7细胞胞内ROS的释放发挥抗炎作用。

图6 MA对LPS诱导RAW264.7细胞ROS水平的影响

在巨噬细胞中，ROS可以作为第二信使参与细胞的增殖、分化和成熟，但在致病因子作用下，ROS在机体中迅速大量表达，通过激活胞内多条信号通路包括JAK-STAT来诱导促炎因子的释放和大量炎症介质的产生[23]。故测定了MA对RAW264.7细胞中ROS水平的影响，试验结果显示，MA能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞ROS的释放，与李桂兰等[5]发现的MA具有一定的抗氧化功能相一致。

由此，根据研究结果和之前的相关研究，提出山楂酸发挥抗炎保护作用可能的分子机制如图7所示。

图7 山楂酸发挥抗炎保护作用的分子机制

3 结论

在脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应模型中，山楂酸能通过抑制一氧化氮的生成、抑制白介素6和白介素1β释放，增加白介素10的含量发挥抗炎保护作用，研究结果表明山楂酸可能通过抑制Janus激酶2/信号转导与转录激活子3信号通路发挥抗炎作用，其机制还与抑制胞内活性氧的释放相关。但山楂酸如何通过活性氧调控Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路，山楂酸是否还可以通过其他一些方式来抑制Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路，相关的机制研究还有待进一步的深入。