王 莹， 韩恩善,夏 潇

甲状腺癌(TC)是最常见的内分泌相关肿瘤，其发病率呈上升趋势。TC的影响范围很广，从青春期儿童到老年人均易发病，女性发病率是男性的3倍[1]。甲状腺外科手术是TC的主要治疗方法，尽管大多数患者经治疗后能取得良好的总体生存率，然而治疗后总体预后较差，急须发现可用于TC诊断及预后判断的生物标志物以改善预后。细胞周期蛋白 D1 (Cyclin D1)和增殖细胞核抗原(Ki-67)在多种肿瘤的组织细胞增殖和凋亡过程中具有重要调控作用，可引起细胞异常增殖，最终导致恶性肿瘤发生和发展[2-4]。但是目前关于两种生物标志物在TC中的临床作用尚不完全清晰。因此本研究采用免疫组化方法检测Cyclin D1和Ki-67在甲状腺癌组织中的表达，并分析其与患者病理诊断及预后的相关性，从而评价其临床的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2015年2月-2019年12月于本院治疗的TC患者纳入研究，共收集131例TC组织和癌旁组织。同时，还从接受甲状腺全切术的良性甲状腺病变患者中收集122份正常甲状腺组织作为正常对照。本研究经医学伦理委员会批准，患者或监护人知情同意。

1.1.1 纳入标准：经病理诊断为TC且其他器官无严重疾病；手术前3周未接受任何放射治疗,且甲状腺功能正常者；患者无其他恶性肿瘤，无放射史。

1.1.2 排除标准：有远处转移或肺转移(并发其他肿瘤或原发性肺癌)；因严重的精神疾病或情绪不稳定而无法合作者；患有心肌梗死、中风、心力衰竭和心房纤颤等慢性疾病者；有放射碘治疗史者。

1.2 方法：所有组织切片均保存于10%中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋。获得5 μm厚的切片，并使用标准的链霉亲和素生物素过氧化物酶免疫组织化学方法表达Cyclin D1和Ki-67。 Cyclin D1(abcam)和Ki-67(abcam)单克隆抗体用于研究。 其中，阴性对照用PBS代替一抗。免疫组化染色评分通过抗原抗体特异性反应集合阳性细胞百分比及染色强弱计算，所有结果均采用同一评分标准。

1.3 随访：治疗后1个月通过门诊进行随访，并用电话和电子邮件与每位患者进行联系。 第1年每3个月随访1次，第2年每6个月随访1次，此后每年1次。 随访于2019年12月31日结束，随访率为100%。 记录所有患者的生存状况及所有相关信息，包括临床数据和5年随访的数据。

1.4 统计学方法：使用SPSS 21.0统计软件，使用χ2和Fisher精确概率检验分析Cyclin D1和Ki-67表达的比较，应用Kaplan-Meier方法分析TC患者的5年生存率，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者一般资料：病例组中男性43例，女性88例；年龄15～78岁，平均(45.3±8.2)岁。对照组中男性38例，女性84例；年龄20～74岁，平均(47.1±8.7)岁。2组患者间的性别和年龄差异均无统计学意义(P> 0.05)。病例组肿瘤直径≥1.0 cm 87例，直径≤1.0 cm 44例。根据甲状腺肿瘤的组织病理学类型，乳头状癌76例，滤泡状癌29例，甲状腺髓样癌26例。131例患者中52例发生囊膜浸润，其余79例无囊膜浸润。根据国际癌症控制联盟(UICC)提出的肿瘤-淋巴结转移(TNM)分期标准：Ⅰ+Ⅱ期51例，Ⅲ+Ⅳ期80例；69例有淋巴结转移，62例无淋巴结转移。

2.2 Cyclin D1和Ki-67表达与TC患者临床病例特征的关系：Cyclin D1和Ki-67表达在性别、年龄、组织病理学类型和荚膜浸润方面差异无统计学意义(P>0.05)。 Cyclin D1表达阳性率明显升高，肿瘤直径≥1.0 cm的TC组织中的Ki-67表达阳性率低于肿瘤直径<1.0 cm的TC组织中的表达(P<0.05)。与Ⅰ+Ⅱ期患者相比，Ⅲ+Ⅳ期Cyclin D1表达阳性率升高，而Ki-67表达阳性率降低(P<0.05)。 与无淋巴结转移的患者相比，有淋巴结转移的患者具有更高的Cyclin D1表达阳性率和较低的Ki-67表达阳性率(P<0.05)，见表1。

表1 Cyclin D1和Ki-67表达与TC患者临床病例特征的关系[n(%)]

2.3 Cyclin D1和Ki-67表达与TC患者预后的关系:131例受试者随访5年后，53例生存，78例死亡，TC的死亡率为59.5%。Cyclin D1和Ki-67表达不同的患者Kaplan-Meier曲线见图1(目录后)。Cyclin D1阳性表达患者5年生存率为28.44%，显著低于Cyclin D1阴性表达患者(P<0.05)。Ki-67阴性表达患者5年生存率为35.2%(37/105)，这与Ki-67阳性表达的TC患者5年生存率差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

TC在我国为常发肿瘤，女性比男性的发病率高3倍，同时随着年龄增加，其发病率逐渐增加，而由于临床诊治方法的缺乏，使其严重影响患者的生活质量[5]。随着分子生物学技术的快速发展，为甲状腺癌的早期诊断及预后判断提供了可能。

Cyclin D1是肿瘤细胞所依赖的重要细胞周期调节因子，其过表达可用于多种肿瘤的诊断及预后判断[6-8]。关高娃等[9]研究发现Cyclin D1表达与结肠癌患者的长期生存率显著相关，其高表达是结肠癌预后的独立危险因素。冯钦等[10]研究发现在口腔鳞癌中Cyclin D1表达显著升高，同时影响患者的总体生存率。蒋艳等[11]研究发现Cyclin D1在良性叶状肿瘤与纤维腺瘤的免疫表型存在差异，可用于二者的诊断及预后评估。有研究表明[12-13]，Cyclin D1表达可用于侵袭性分化型甲状腺癌的临床诊断，同时与分化型甲状腺癌的发生发展密切相关。本研究结果显示，在甲状腺癌中，Cyclin D1表达在性别、年龄、组织病理学类型和荚膜浸润方面差异无统计学意义(P> 0.05)。 然而，Cyclin D1表达阳性率与肿瘤直径、病理分期及淋巴结转移显著相关(P<0.05)，同时其表达与患者不良预后显著相关。本研究进一步证实Cyclin D1在甲状腺癌中的作用，为其应用于甲状腺癌临床诊断及预后评估提供可能。

Ki-67于细胞核内被发现，与细胞增殖密切相关，同时随着细胞周期的变化，Ki-67的表达呈动态变化过程，其已作为多种肿瘤的生物标志物应用于临床诊断及预后评估。在弥漫大B细胞淋巴瘤中[14]，Ki-67表达增高，同时与患者临床病例特征及预后显著相关，可作为患者预后的独立危险因素。张国臣等[15]研究发现，Ki-67在胶质瘤中阳性表达率较高，尤其是高级别胶质瘤，可用于胶质瘤疗效评估的重要指标。在老年胃癌中[16]，Ki-67在癌前病变及早期胃癌中表达增高，提示其与胃癌的发生发展密切相关，可作为老年人胃癌的早期诊断指标。周冠磊等[17]研究发现，在甲状腺微小乳头状癌中，Ki-67蛋白阳性表达率仅与是否发生淋巴结转移相关，可判断疾病的临床进展。本研究发现在甲状腺癌中，Ki-67表达在性别、年龄、组织病理学类型和荚膜浸润方面差异无统计学意义(P> 0.05)，而与肿瘤直径、病理分期及淋巴结转移显著相关(P<0.05)，同时其表达与患者不良预后显著相关。