罗明秀,马海江,张 甜 ,田 嫁,李正正,陈静宏,曹峻岭

骨关节炎(OA)是一种慢性、退行性关节疾病，以关节基质崩解、软骨细胞的明显减少为主要特性，但也存在滑膜炎症、骨赘形成和软骨下骨硬化等特征[1]。根据统计，全球OA的发病率在过去的近30年里增长了近20倍，并呈现出一定的年龄和性别特点[2]。研究表明，OA患者软骨细胞的细胞外基质(ECM)较正常人显著减少，ECM减少可使细胞生存环境及生存信号丧失而导致软骨细胞发生凋亡[3]。多聚蛋白聚糖(AG)是分布在关节软骨ECM中最主要的蛋白聚糖之一，它和胶原是构成ECM的主要生物大分子，在维持ECM组织结构和细胞调节机制方面起着很重要作用。AG含有大量的酸性基团，尤其是SO42-可吸纳大量的水分，以保证软骨的黏弹性以及抗压能力[4]。研究表明，正常关节软骨中硫酸酯酶表达较低且局限于软骨表层，而OA软骨硫酸酯酶mRNA和蛋白水平升高，可能引起蛋白聚糖硫酸化修饰及生长因子活性改变，从而导致OA软骨细胞活性异常和软骨基质降解[5]。转化生长因子β(TGF-β)信号在软骨的内稳态平衡与修复中有关键性的作用[6-7]，在OA样的关节退行性改变中都与TGF-β信号通路有关[8]。引起OA的因素有很多，但目前仍缺乏有效的干预措施来阻止或减缓OA的发展进程。因此，本研究以C-28/I2人软骨细胞系为研究对象，构建TGF-β1慢病毒载体，观察TGF-β1降低后软骨蛋白聚糖硫酸化修饰相关酶表达的情况，旨在探讨骨关节病的病因和可能的发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料:C-28/I2人软骨细胞系由美国康乃尔大学Mary B.Goldrin 教授惠赠。GV-248质粒(上海吉凯基因化学技术有限公司)，胎牛血清(鼎国,北京)，胰酶(Gibco，美国)，DMEM-F12培养基(HyClone,美国)，引物(上海吉凯基因化学技术有限公司)，蛋白提取试剂盒(上海鼎国生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；ECL发光试剂盒(Thermo,美国)；TGF-β1兔多抗(GeneTex,美国)，PAPSS2兔多抗(Biossion,9030R,中国)，PAPST1单抗(Santa Cruz,517131,美国)，CHST15兔多抗(Abcam,229223,美国)，β-actin单抗(Santa Cruz,美国)，山羊抗兔IgG(CST,7074,美国)，山羊抗鼠IgG(CST,7076,美国)。

1.2 TGF-β慢病毒包装:设计3个人源TGF-β1基因RNAi靶点，即：TGFβ1-RNAi(17674-2)、TGFβ1-RNAi(17676-1)和TGFβ1-RNAi(17677-1)，用克隆载体GV-248构建重组质粒，测序鉴定筛选阳性克隆。提取质粒进行慢病毒包装，用目的质粒载体GV-248、病毒包装辅助质粒载体Helper1.0和Helper1.0共同转染293T细胞，48 h后收集细胞上清液，加入病毒保存液，充分溶解后以10 000 r/min离心5 min,收集上清液，用荧光法对病毒滴度进行检测。

1.3 C-28/I2人软骨细胞的培养:从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37 ℃水浴中，并不时晃动使其尽快解冻。待细胞冻存物完全解冻后以1 000 r/min离心5 min，用75%酒精擦拭冻存管消毒后移至超净工作台。吸去冻存液上清液，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的24 cm2培养瓶中，轻轻晃匀后放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后观察细胞生长情况，并更换一次新鲜培养液继续培养。待细胞增殖达80%左右时，加入1 mL专用胰酶消化液(0.05%胰酶+0.02%EDTA溶于500 mL D-Hanks’液中)于37 ℃消化8～10 min后进行传代培养，保持细胞良好的生长状态。

1.4 C-28/I2细胞TGF-β1慢病毒感染:将处于对数生长期的C-28/I2人软骨细胞用胰酶消化后，用完全培养基(10%血清+1%双抗)制成5×104个/mL细胞悬液，从中取出2 mL细胞悬液接种于6孔板中，继续培养至细胞量达到20%时再更换成1 mL新鲜培养基，按照感染MOI值80加入TGF-β1慢病毒和HiTransG P感染增强版进行感染。感染后继续培养16 h后更换为常规培养基继续培养，72 h后用荧光显微镜观察GFP表达情况并拍照。

1.5 Western-blot检测慢病毒感染C-28/I2细胞后各指标蛋白的表达:病毒感染C-28/I2软骨细胞72 h后，用蛋白质提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。然后加入1/5 体积的6×loading buffer混匀，100 ℃金属浴煮10 min，短暂离心后于-80 ℃温度下保存备用。各组蛋白样品按50 μg等量上样进行10%SDS-PAGE电泳(浓缩胶80 mA,20 min；分离胶120 mA,1 h)；电泳结束，将蛋白转移到PVDF膜上(4 ℃、300 mA恒流,150 min)。用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1 h，分别加入用封闭液稀释的抗体，如：兔多抗TGF-β1(1∶2 000)、PAPSS2(1∶1 000)、CHST15(1∶500)和单抗PAPST1(1∶200)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃冰箱过夜。TBST洗膜4次，每次8 min。用封闭液稀释相应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)和山羊抗兔IgG(1∶10 000)，室温下孵育PVDF膜1.5 h，TBST充分洗膜4次，每次8 min。ECL发光，用凝胶成像系统采集图像并进行灰度值测定。

2 结果

2.1 TGF-β1慢病毒包装滴度检测:TGF-β1 3个不同靶点慢病毒RNAi经测序证实全部与目的基因序列相通，对其用293T细胞和GV-248质粒载体包装后用荧光法测定其滴度，3个不同靶点TGF-β1慢病毒在加病毒10 μl时荧光中GFP表达最强、1 μl时次之，而0.1 μl时最弱。根据此荧光法可测得3种TGF-β1慢病毒的病毒滴度，选取加1 μl时计算得到的病毒滴度为后续试验的用量。

2.2 TGF-β1慢病毒感染C-28/I2细胞荧光表达:根据感染预实验，选取KD1、KD2和KD3即LV-TGFβ1-RNAi(17674-2)、LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)和LV-TGFβ1-RNAi(17677-1)病毒用量，分别为40 μl、40 μl和53.3 μl对C-28/I2人软骨细胞系进行感染。感染72 h 后，3个不同靶点TGF-β1慢病毒感染C-28/I2细胞的GFP荧光表达与对照组相比都达到了80%左右且细胞状态良好，可进行后续实验。

2.3 TGF-β1慢病毒感染C-28/I2细胞后TGF-β1、PAPSS2、PAPST1和CHST15蛋白的表达:将3个不同靶点TGF-β1慢病毒感染C-28/I2人软骨细胞后提取总蛋白进行Western-blot实验，如图1所示(目录后)，相对于NC组，KD1、KD2和KD3 3组中TGF-β1的表达均明显降低，其中KD2即LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)组TGF-β1的表达降低最为显著(P<0.05)，故后续只选择KD2即LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)慢病毒感染细胞组的蛋白进行下游相关酶蛋白分子的检测。相对于NC组，PAPSS2、PAPST1和CHST15蛋白的表达都有所降低，其中PAPSS2降低最显著(P<0.05)，而CHST15的表达降低不明显，见图1(目录后)。

3 讨论

TGF-β是其超家族成员之一，参与调节细胞的增殖、分化、凋亡和细胞外基质的合成等过程，尤其是在软骨的形成、维持和修复过程中均发挥着重要的作用[9]。TGF-β在人类中有3种结构相似的亚型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)，各亚型之间核苷酸序列高度同源并被不同的基因所编码，其受体有3种形式分别为TβRⅠ型、TβRⅡ型和 TβRⅢ型[10]。研发发现，转基因小鼠中TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)的失活促进了终端软骨细胞的分化[11]，而TβRⅡ显著抑制的小鼠能够引起OA样的病理性肥大和骨赘增生等症状[12]。研究者在利用小牛关节软骨原代细胞的相关实验中发现，TGF-β能够保护软骨的机制可能与下游目标分子PAPS 合成酶2(PAPSS2)有关，TGF-β能够维持软骨的生物化学和生物力学性能并能够调节PAPSS2的表达和小鼠关节软骨中糖胺聚糖的硫酸化水平[13]。进一步研究发现，TGF-β可能通过依赖p38和Smad的信号通路机制，并通过调控PAPSS2基因的表达能够同时使得SOX9蛋白稳定表达[14]。TGF-β/Smad信号通路参与早期软骨细胞形成，并在维持软骨细胞内稳态过程中发挥着重要作用[15]。

PAPSS2、PAPS转运体1(PAPST1)和N-乙酰氨基半乳糖胺-4,6-硫酸-硫酸转移酶[CHST15]是软骨聚集蛋白聚糖AG硫酸化修饰过程中相关的3种酶蛋白因子。我们前期研究发现，这3种酶蛋白因子在大骨节病(KBD)儿童软骨以及KBD可疑致病因素DON毒素诱导的C-28/I2人软骨细胞中的表达比正常对照组均显著降低[16-17]。KBD是一种区别于OA和风湿性关节炎(RA)的慢性、地方性骨关节病[18]，其典型特征包括ECM调节紊乱，基质金属蛋白酶活性增加，以致组织完整性受损[19]。早期研究发现KBD患者中糖胺聚糖硫酸化代谢异常，表现为KBD患者关节软骨ECM中硫酸软骨素糖胺聚糖的表达显著降低。而在本实验结果显示，TGF-β1慢病毒感染C-28/I2细胞后，TGF-β1、PAPSS2、PAPST1和CHST15的表达均较正常组细胞减少，这表明TGF-β在软骨细胞中有重要作用，且有可能通过调控下游PAPSS2、PAPST1和CHST15的表达来对软骨ECM的蛋白聚糖硫酸化修饰产生一定影响。

综上所述，TGF-β对软骨细胞的保护作用可能是通过调节多聚蛋白聚糖AG硫酸化修饰相关酶PAPSS2、PAPST1和CHST15的表达来实现的，为OA等骨关节疾病的发病机制提供了实验依据，但具体的信号通路机制还有待更进一步的实验研究加以证实。