陈 鑫 李国熊 方家恒 孙倚天 董 赛 杨文君

杭州师范大学附属医院消化内科1(310015) 病理科2

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种在肠道菌群的参与下，由环境等因素作用于遗传易感者引起的肠道黏膜异常免疫反应，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)。随着发展中国家的工业化进程，其IBD发病率呈上升趋势[1]。岩藻糖基转移酶(fucosyltransferases, FUTs)可催化蛋白质完成岩藻糖基化，从而影响蛋白质的生物学功能，参与受体激活、信号转导等多种重要的生命进程。其中，FUT2和FUT3可特异性催化人类组织血型抗原(histo-blood group antigens)形成，并与宿主与肠道微生物的相互作用以及IBD肠道黏膜炎症之间存在密切联系[2]。Coyne等[3]发现，拟杆菌可经由与宿主肠上皮细胞类似的途径对其表面荚膜多糖和糖蛋白进行岩藻糖基化修饰，通过与宿主协调表达岩藻糖以保障自身定植；Goto等[4]发现由FUT2调控的肠上皮细胞岩藻糖基化对致病菌感染具有保护作用。然而，国内外相关研究多为动物实验研究，关于IBD患者炎症黏膜FUT2和FUT3表达的临床研究鲜见报道。本研究收集IBD患者的临床资料，结合结肠镜活检标本FUT2、FUT3表达检测，旨在探讨不同临床特征IBD患者的FUT2、FUT3表达变化，以期有助于IBD的临床诊断和疗效评价。

对象与方法

一、研究对象

连续纳入于2019年1月—2020年12月在杭州师范大学附属医院就诊、初诊为IBD活动期的汉族人群。IBD诊断符合2012年版我国IBD诊治共识[5]。排除标准：①无法明确诊断；②其他肠道疾病，包括痢疾、肠结核、肠伤寒、耶尔森菌肠炎、弯曲杆菌结肠炎、嗜酸细胞性结肠炎、放射性肠炎、外伤、缺血性肠炎、结直肠黏膜脱垂综合征、各种寄生虫感染、阿米巴结肠炎、药物性肠病、肠型白塞病、单纯性溃疡、淀粉样变性等；③入组前2个月内使用抗菌药物。结果共107例活动期IBD患者纳入研究，同期行健康体检、结肠镜检查无异常发现的66例汉族个体作为对照组。研究方案经医院伦理委员会审核批准[2018(伦02)-KS-012]。

二、方法

1. 免疫组化染色检测肠黏膜FUT2、FUT3表达：IBD组收集开始药物治疗前的结肠镜活检标本(取炎症黏膜组织)，对照组收集正常结肠黏膜组织，4%甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋、连续切片，常规脱蜡，采用EnVision二步法行FUT2、FUT3免疫组化染色。兔FUT2、FUT3抗体为Biorbyt Ltd.产品，二步法免疫组化试剂盒(多聚HRP标记抗兔/鼠IgG，DAB显色液)为武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司产品，按试剂盒说明书进行操作。光学显微镜下观察到褐黄色阳性信号判定为相关抗原表达阳性，未观察到褐黄色信号判定为表达阴性。由2名具有高级职称的病理医师读片，协商得出结果。

使用用徕卡DMI4000B倒置显微镜对每张切片的FUT2、FUT3显色结果进行观察、定位。于高倍视野(×200)下随机选取3个彼此不重叠的视野采集图像，将同一张切片的3幅图像输入Image-Pro Plus 6.0软件进行分析，分别计算平均光密度(average optical density, AOD)，3幅图像的AOD值均数作为该张切片的FUT2、FUT3相对表达量。

2. 临床资料收集和疾病严重程度评估：采集入组IBD患者的人口统计学资料、生活习惯、临床表现和实验室检查结果。实验室指标主要包括C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、粪便钙卫蛋白(fecal calprotectin, FC)和血红蛋白(hemoglobin, Hb)。炎症指标结果异常判定标准：CRP10 mg/L；ESR26 mm/h；FC50 μg/g。

UC疾病严重程度的评估采用改良 Mayo评分，CD疾病严重程度的评估采用Best CD活动指数(CD activity indext, CDAI)。病变范围/部位分型采用蒙特利尔分型[5]。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料

107例IBD患者中，UC 70例，CD 37例。UC组男性48例，女性22例，年龄(49.6±15.6)岁(15～83岁)；CD组男性27例，女性10例，年龄(37.6±15.7)岁(15～72岁)。66例健康对照者中男性48例，女性18例，年龄(52.5±14.0)岁(18～87岁)。三组间性别构成和年龄差异均无统计学意义(P均0.05)。

二、肠黏膜FUT2、FUT3表达

IBD患者和健康对照者肠黏膜FUT2、FUT3显色情况见图1。CD组FUT2阳性率低于对照组，FUT3阳性率高于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；UC组与对照组间FUT2、FUT3阳性率无明显差异(P均0.05；表1)。

A：非炎症黏膜FUT2表达阳性；B：非炎症黏膜FUT2表达阴性 ；C：非炎症黏膜FUT3表达阳性；D：非炎症黏膜FUT3表达阴性；E：IBD炎症黏膜FUT2表达阳性；F：IBD炎症黏膜FUT2表达阴性；G：IBD炎症黏膜FUT3表达阳性；H：IBD炎症黏膜FUT3表达阴性图1 肠黏膜FUT2、FUT3显色情况(免疫组化染色，×200)

表1 IBD组与对照组肠黏膜FUT2、FUT3表达阳性率比较

进一步根据AOD均值行半定量分析，UC组FUT2、FUT3相对表达量均高于对照组，CD组FUT2相对表达量低于对照组，FUT3相对表达量高于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05；表2)。

表2 IBD组与对照组肠黏膜FUT2、FUT3相对表达量比较

三、FUT2、FUT3表达与IBD患者临床特征的关系

不同疾病严重程度、病变范围/部位、临床表现(腹痛、腹泻、发热、贫血)以及不同生活习惯(吸烟、饮酒)IBD患者的肠黏膜FUT2、FUT3表达差异均无统计学意义(P均0.05；表3、表4)。进一步行多元线性回归分析，结果同样表明FUT2、FUT3表达与IBD患者的临床表现和生活习惯无明显相关性(P均0.05；表5)。

表3 UC、CD组肠黏膜FUT2、FUT3表达与疾病严重程度和病变范围/部位的关系

表4 UC、CD组肠黏膜FUT2、FUT3表达与临床表现和生活习惯的关系

表5 肠黏膜FUT2、FUT3表达与IBD患者临床表现和生活习惯的多因素分析(多元线性回归分析)

四、FUT2、FUT3表达与炎症指标的关系

CRP、ESR、FC水平升高与正常IBD患者的肠黏膜FUT2、FUT3表达分布见图2。3项炎症指标升高与正常组间FUT2表达差异均无统计学意义(P均0.05)；CRP、FC升高与正常组间FUT3表达差异显著(P均<0.05；表6)。进一步行Pearson相关系数分析，结果同样表明FUT2表达与各项炎症指标之间无明显相关性(P均0.05)，FUT3表达与CRP、FC水平之间存在一定的正相关性(r=0.259,P=0.007;r=0.388,P=0.001)。

图2 CRP、ESR、FC水平升高与正常IBD组间FUT2、 FUT3 AOD分布比较

表6 IBD患者肠黏膜FUT2、FUT3表达与炎症指标的关系

讨 论

近20年来，中国IBD病例数呈增长迅速，流行病学调查显示，南方城市IBD标化发病率为3.14/10万，北方城市为1.77/10万[6]。尽管临床医师对IBD的关注度已有明显提升，但其精准诊断和治疗仍面临诸多挑战。ABH抗原和Lewis抗原统称人类组织血型抗原，其合成受FUT2、FUT3特异性调节(图3)。FUT2、FUT3在胃肠道黏膜组织和分泌液中高表达，不仅可作为肠道菌群的碳源和结合位点，还可影响蛋白质的生物学功能，参与信号转导、受体激活等诸多重要生命进程[2]。已有较多动物实验研究证实FUT2、FUT3与IBD的发生、发展有关，但相关临床研究鲜见报道。

图3 人类组织血型抗原合成步骤

鉴于长期应用抗菌药物会降低肠黏膜岩藻糖含量[7]，考虑到我国的抗菌药物使用现状，本研究设计时设定排除入组前2个月内使用抗菌药物的患者。EnVison二步法免疫组化染色显示，健康对照者肠黏膜FUT2、FUT3阳性率分别为78.8%、80.3%，UC和CD患者的相应数据分别为81.4%、84.3%和59.5%、94.6%，CD组与对照组间存在显著差异。进一步行半定量AOD值分析，UC组FUT2、FUT3相对表达量显著高于对照组，CD组FUT2相对表达量显著低于对照组，FUT3相对表达量显著高于对照组，表达变化趋势与阳性率分析结果基本一致。单因素和多因素分析显示，肠黏膜FUT2、FUT3表达与IBD患者的疾病严重程度(轻、中、重度)、病变范围/部位(蒙特利尔分型)、临床表现(腹痛、腹泻、发热、贫血)和烟酒嗜好均无明显相关性；Pearson相关系数分析显示，FUT3表达与临床常用炎症指标CRP和FC之间存在一定正相关性，CRP和FC升高者肠黏膜FUT3表达亦显著升高；FUT2表达与CRP、ESR、FC之间均不存在相关性。

有研究显示，20%的白种人因FUT2基因多态性而不表达ABO血型抗原[8]。关于FUT2基因多态性与IBD的关系，不同国家、不同种族人群的研究结果不完全一致。国内有学者分析了FUT2基因多态性对新疆地区汉族和维吾尔族人群UC易感性的影响，发现rs281377位点多态性与汉族人群的UC易感性相关，rs1047781位点多态性与维吾尔族人群的UC易感性相关，而rs601338位点多态性与两组人群的UC易感性均相关[9]。另一项国内研究[10]则显示FUT2基因多态性与东南地区人群的CD易感性相关，与UC易感性无关。其他国内学者的研究也证实了FUT2基因多态性与汉族人群CD易感性之间的相关性[11]。McGovern等[8]对白种人的全基因组关联研究同样表明FUT2基因多态性与CD易感性相关。韩国学者的研究[12]显示，FUT2非分泌型等位基因与CD显著相关，分泌型FUT2是亚洲人群罹患CD的保护因素。本组研究对象均为汉族，CD组FUT2阳性率仅为59.5%，远低于对照组的78.8%，FUT2相对表达量亦显著低于对照组，在蛋白水平证实了FUT2基因弱功能性或失功能性突变与CD易感性之间的联系。此外，本研究还发现CD组FUT3阳性率和相对表达量显著高于对照组。国内其他学者的研究表明FUT3基因rs28362459、rs3745635位点突变与特定病变部位的CD发病风险有关[11，13]。

尽管大量研究指出了FUT2、FUT3基因多态性与IBD易感性之间的联系，但鲜有研究通过检测两者在肠黏膜中的表达变化分析其与IBD的关系。国内有学者采用免疫组化方法检测了7例浙江籍汉族UC患者乙状结肠黏膜中与FUT2、FUT3相关的Lewis a、b抗原表达，发现炎症和非炎症黏膜隐窝上皮的Lewis a抗原表达均显著高于作为对照组的结肠息肉患者，其原因可能为FUT2基因突变使其编码蛋白失去正常催化功能，血型前体物质不能被催化生成H抗原，而只能经由FUT3酶催化生成Lewis a抗原，导致Lewis a抗原过表达，通过影响肠道菌群结构，对UC发病起促进作用[14-15]。本组UC患者FUT2相对表达量显著高于对照组，CD患者FUT2相对表达量显著低于对照组，提示检测肠黏膜FUT2表达或可为IBD的诊断以及UC与CD的鉴别提供帮助，但仍需增加样本量进一步明确。

研究显示炎症反应可影响多种糖蛋白的糖基化水平。Delmotte等[16]发现促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可上调人支气管黏膜中的FUT3基因表达及其酶活性，与严重肺部感染患者气道黏液中的唾液酸化Lewis x抗原表位表达增加相一致。Magalhães等[17]的研究也显示幽门螺杆菌感染和胃黏膜炎症可上调FUT3基因并增加唾液酸化Lewis a/x抗原表达。本研究同样发现UC和CD患者肠道炎症黏膜FUT3表达均显著高于健康对照者。

在IBD患者的肠黏膜中可观察到糖基化水平降低，提示黏液层缺陷可能导致细菌与上皮接触的机会增加，从而触发肠道炎症反应[18]。研究发现，在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型中，能维持肠道稳态、对结肠炎发挥保护作用的活化转录因子3(ATF3)缺失可使肠上皮岩藻糖基化水平和FUT2表达下调[19]；而给予外源性游离岩藻糖可显著减轻模型小鼠的结肠炎症，缓解其腹泻、血便、体质量减轻等结肠炎症状[20-21]。Brazil等[22]发现，FUT3系通过催化Lewis a抗原的生物学合成介导多形核白细胞经肠上皮进入肠腔，从而促进肠道炎症反应。本研究也关注了FUT2、FUT3表达与临床常用IBD炎症指标的相关性，发现CRP、FC水平升高的IBD患者FUT3表达显著高于相应指标正常者，相关性分析显示FUT3表达与CRP、FC之间存在一定的正相关性，表明该指标或可用于IBD的疗效评估。

综上所述，肠黏膜FUT2、FUT3表达或可成为IBD的辅助诊断和疗效评估指标。本研究中FUT2、FUT3表达与IBD患者的疾病严重程度、病变范围/部位、临床表现、烟酒嗜好均无相关性，可能与样本量有限有关。后续拟继续增加样本量，并对两者表达情况进行治疗前后对比，以期更精准地探索IBD患者肠黏膜FUT2、FUT3表达的临床意义。